DNA文库的构建和目标基因的筛选.pptxVIP

DNA文库的构建和目标基因的筛选;基因库(gene pool)：特定生物体全基因组的集合(天然存在) 基因文库(gene library)：从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在(人工构建)。根据构建方法的不同，基因文库分为：;3;4;;; 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：Sau3AI或MboI等，这样DNA酶解片段的大小可控。;3、载体和受体的选择与制备 出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的l-DNA或柯斯质粒；对于大型基因组(如动植物和人类)需使用YAC或BAC载体。 由于绝大多数真核生物的mRNA小于10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体通常选质粒或插入型l载体。;9;10;第二节 cDNA基因文库的构建;二、cDNA文库的构建： 1、RNA的分离 mRNA是构建cDNA文库的起始材料。总RNA中绝大多数是tRNA和rRNA，而mRNA只占总RNA的1﹪-5﹪，平均为2%，mRNA的比例取决于细胞类型和细胞的生理状态。由于mRNA在总RNA中所占比例很小，因此从总RNA中富集mRNA是构建cDNA文库的一个重要步骤。通过降低rRNA和tRNA含量，可大大提高筛选到目的基因的可能性。利用Poly(A)尾巴纯化或直接提取mRNA。 1）根据研究目标合理选择器官、组织和细胞类型以及合理的环境条件，用于提取RNA。 2）保持mRNA的完整性，是构建全长cDNA文库的核心。 3）选取合适的提取方法，除完整性外，mRNA还要求纯度高、DNA污染少，最好是采用无RNase的DNase去除杂质DNA。 4）RNA定量准确，保存合理。 5）根据目标和条件决定是否需要纯化mRNA或直接使用总RNA。;2、第一链cDNA的合成 由mRNA到cDNA的过程称为反转录(reverse transcription,RT)，由反转录酶(reverse transcriptase, RTase)催化。反转录酶是依赖RNA的DNA聚合酶，合成DNA是需要引物引导。常用的引物有： oligo(dT)引物：在反应体系中加入高浓度的oligo(dT)引物， oligo(dT)引物与mRNA 3’末端的poly(A)配对，引导反转录酶以mRNA为模板合成第一链cDNA，反转录的是整个表达谱，可以产生全长cDNA，应用最广。 随机引物：与mRNA分子内的多处配对，从多个位置合成cDNA第一链，反转录的几乎是整个表达谱，最多只能产生近全长cDNA，适合于得到总cDNA的5’末端。 基因特异引物(gene-specific primer, GSP)：仅反转录特定目标基因cDNA的5’末端。 有AMV和MMLV两种RTase，最适温度分别为42℃和37℃，需要敲除其RNase H活性，较高温度反转录有利于打开mRNA的二级结构，得到全长cDNA。 反转录过程中要防止mRNA降解，可以添加RNase抑制剂。;3、第二链cDNA的合成 cDNA第二链的合成就是将上一步形成的mRNA-cDNA杂交双链变成互补双链cDNA的过程。 4种cDNA第二链合成的方法： 自身引导合成法：解离的cDNA第一链的3’末端会产生一个发夹状结构，可以引导第二链的合成，然后用S1核酸酶处理去除发夹结构。得到的5’不完整，且S1核酸酶处理不好控制，易导致cDNA的丢失，所以该法现已少用。 置换合成法：RNase H、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、DNA连接酶联合处理，得到近全长cDNA，5’缺失短序列。 引导合成法：利用末端转移酶在cDNA第一链的3’末端加上poly(dC)尾巴，利用poly(dG)为引物引导第二链合成，利用同源多聚尾与载体进行重组。 引物-衔接头合成法：引导合成法的改进型，在反转录引物和poly(dG)引物的5’引入优化设计的人工接头，可用PCR扩增广大总cDNA，也为总cDNA与载体的连接提供了酶切位点。;15;16;17;18;19;20;21;22;23;24;25;26;27;28;29;30;31;32;33;感谢观看！