基因工程操作步骤.pptxVIP

基因工程操作步骤第1页/共46页 知识回顾：基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用 载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。 才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。第2页/共46页 一、目的基因的获取1目的基因主要是编码蛋白质的基因：如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等。2获取目的基因的常用方法：1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成第3页/共46页 原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游 编码区下游 与RNA聚合酶结合位点启动子终止子①不编码蛋白质。：编码蛋白质 ,连续不间断编码区非编码区②调控遗传信息表达,上 游有RNA聚合酶结合位点:基因结构第4页/共46页 真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区内含子 外显子 启动子终止子编码区上游 编码区下游 编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用,上游有RNA聚合 酶结合位点(启动子)。与RNA聚合酶结合位点基因结构第5页/共46页 1. 从基因文库中获取目的基因1. 基因文库的概念:将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。2. 基因文库的种类:基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库第6页/共46页 基因组DNA文库与cDNA文库某生物体内全部DNA 许多DNA片段受体菌群体限制酶与运载体连接导入基因组文库cDNA反转录受体菌群体与运载体连接导入cDNA文库某种生物某个时期的mRNA第7页/共46页 真核细胞的cDNA的获取编码区非编码区非编码区DNA聚合酶剪接有关的酶RNA聚合酶mRNA前体mRNA单链DNAcDNA逆转录酶转录剪接逆转录复制启动子终止子基因不含非编码序列。即不含非编码区和内含子第8页/共46页 基因组DNA文库与cDNA文库的比较 文库类型 cDNA文库 基因组文库 文库大小基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段） 基因多少 物种间的基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以第9页/共46页 ③怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因 根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。第10页/共46页 2.利用PCR技术扩增目的基因1概念：PCR全称为_______________，是一项 在生物____复制___________的核酸合成技术。 2原理：DNA复制原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶多聚酶链式反应体外特定DNA片段3前提：已知目的基因的一段核苷酸序列第11页/共46页 PCR技术的操作过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。 c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。 氢键单链DNA双链DNA链d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加___倍一第12页/共46页 5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G变性复性延伸1.目的基因DNA受热变性，解链；2.引物与单链互补结合；3.合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。5/3/A—G引物Ⅰ第13页/共46页 ③过程：第14页/共46页 PCR技术的操作过程PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增第15页/共46页 PCR技术扩增与DNA复制的比较DNA复制PCR技术场所原理条件解旋方式酶特点结果碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋变复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶