YC_T 365-2010 烟草病毒的测定 逆转录-聚合酶链反应法.docx

ICS 65.160 X 85 备 案 号 ： 2 9 8 4 1 — 2 0 1 0 中 华 人 民 共 和 国 烟 草 行 业 标 准 YC/T 365—2010 烟草病毒的测定 逆转录-聚合酶链反应法 Tobacco virus detection—Reverse transcription-polymerase chain reaction 2010-10-11 发布 2010-10-15实施 国家烟草专卖局 发 布 I YC/T 365—2010 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家烟草专卖局提出。 本标准由全国烟草标准化技术委员会农业分技术委员会(SAC/TC 144/SC 2)归口。 本标准起草单位：中国烟草总公司黑龙江省公司牡丹江烟草科学研究所。 本标准主要起草人：颜培强、武常青、闫新甫、万秀清、乔婵、孙剑萍、郭兆奎、李丽杰、邱恩建、 王春军、元野、刘德育、陈荣平、黄磊。 1 YC/T 365—2010 烟草病毒的测定 逆转录-聚合酶链反应法 1 范围 本标准规定了用逆转录-聚合酶链反应法测定烟草种子、幼苗及鲜烟叶样品中的烟草花叶病毒 (TMV)、 马铃薯Y 病毒(PVY)、 黄瓜花叶病毒(CMV) 和烟草蚀纹病毒(TEV)。 本标准适用于烟草种子、幼苗和鲜烟叶样品中烟草花叶病毒(TMV)、 马铃薯 Y 病毒(PVY)、 黄瓜 花叶病毒(CMV) 和烟草蚀纹病毒(TEV) 的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 24310—2009 烟草及烟草制品 转基因检测方法 3 术语和定义 GB/T 24310—2009界定的以及下列术语和定义适用于本文件。为了便于使用，以下重复列出了 GB/T 24310—2009 中的一些术语和定义。 3.1 聚合酶链式反应扩增 polymerase chain reaction amplification 模板 DNA 序列在含有4种脱氧核糖核酸(dNTPs)、 引物、DNA 聚合酶等的反应体系中，在仪器中 通过多次高温变性、退火和延伸的循环过程，最终使目标 DNA 片段以几何倍数扩增。 [GB/T 24310—2009,定义3.6] 3.2 逆转录-聚合酶链反应 reverse transcription-polymerase chain reaction 提取组织或细胞中的总RNA, 以其中的 mRNA 作为模板，采用Oligo(dTi?)(5.1) 或随机引物 利用逆转录酶(5.2)反转录成 cDNA, 再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，而获得目的基因或检测 基因表达。 3.3 阳性对照 positive control 经鉴定为含有检测目标成分的对照烟草样品。 [GB/T 24310—2009,定义3.11] 3.4 阴性对照 negative control 经鉴定为不含有检测目标成分的对照烟草样品。 [GB/T 24310—2009,定义3. 12] 2 YC/T 365-2010 3.5 试剂对照 reagent control 检测过程中与样品一起进行各种检测操作的试剂参照样品。 [GB/T 24310—2009,定义3.13] 3.6 特异性 specificity 特异检测某种物质，并可将其与相似物质、杂质或降解物分辨开来的能力。 [GB/T 24310—2009,定义3. 15] 4 试验要求 4.1 防止污染 样品采集和样品研磨过程中，操作人员应戴一次性手套，且每处理一个样品应更换一次。样品前处 理、病毒 RNA 提取、PCR 扩增和电泳与凝胶观察等操作应在相互隔离的不同操作间中进行，样品研磨 应在通风橱中进行。用于提取 RNA 和 PCR 扩增的耗材、用具在使用前均应灭菌，移液器枪头和各种 离心管应一次性使用。 4.2 样品备份 将样品随机分成三份， 一份为实验室样品， 一份为备用样品， 一份为保存样品。 4.3 对照设置 试验中设置阳性对照、阴性对照和试剂对照。 4.4 防止 RNA 降解 磨样前将研钵用液氮(5.3)充分预冻，或将研钵洗净后放入-20℃以下冰箱备用，器皿预先经1% 的 DEPC(5.4) 处理后并烘干。样品 RNA 提取液应存放在一70 ℃以下的冰箱中。 4.5 安全防护 所有试验操作过程中操作人员应穿工作服、戴手套和口罩；接触溴乙锭