DB64 829_2013  葡萄苗木病毒检测技术规程.docx

ICS 65.020 B 16 DB64 宁 夏 回 族 自 治 区 地 方 标 准 DB 64/T 829—2013 葡萄苗木病毒检测技术规程 Rules for virus detection of seedling grapevine 2013-01-04发布 2 0 1 3 - 0 1 - 0 4 实 施 宁夏回族自治区质量技术监督局 发布 DB64/ T 829—2013 前 言 本标准的编写格式符合GB/T1.1-2009 《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》的要求。 本标准由宁夏回族自治区林业局提出并归口。 本标准主要起草单位：宁夏林业研究所股份有限公司、国家经济林木种苗快繁工程技术研究中心、 宁夏森淼种业生物工程有限公司。 本标准主要起草人：徐美隆、沈效东、陈春伶、王国珍、邱文平、李永华。 1 DB64/ T 829—2013 葡萄苗木病毒检测技术规程 1 范围 本标准规定了葡萄苗木病毒检测技术的术语和定义、检测对象、取样部位、抽样、检测方法和质量 要求。 本标准适用于葡萄母本树、组培苗、扦插苗、嫁接苗的病毒检测。 2 术语与定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 脱毒葡萄母本树 由脱毒苗直接繁育或是通过田间选择的优良株系，经检测不带有规定的检测对象，用于提供葡萄种 条的母株。 2.2 葡萄苗木 通过扦插、嫁接、组培等方式繁育的葡萄种苗。 3 检测对象 葡萄苗木病毒主要检测对象： a) 葡萄扇叶病 (Grapevine fanleaf virus,GFLV); b) 葡萄卷叶病-I(Grapevine leafroll associated virus 1, GLRaV-I); c) 葡萄卷叶病- Ⅱ (Grapevine leafroll associated virus 2,GLRaV- Ⅱ); d) 葡萄卷叶病-Ⅲ(Grapevine leafroll associated virus 3,GLRaV-IⅢ); e) 葡萄病毒A(Grapevine virus A, GVA); f) 葡萄病毒B(Grapevine virus B,GVB)。 4 取样部位 病毒检测取样部位见表1。 表1 取样部位 病毒种类 取样部位 葡萄扇叶病(GFLV) 幼嫩叶片 2 DB64/ T 829—2013 表1(续) 病毒种类 取样部位 葡萄卷叶病-I(GLRaV-I) 休眠枝条韧皮部 葡萄卷叶病- Ⅱ(GLRaV- Ⅱ) 休眠枝条韧皮部 葡萄卷叶病-Ⅲ(GLRaV-Ⅲ) 休眠枝条韧皮部 葡萄病毒A(GVA) 休眠枝条韧皮部 葡萄病毒B(GVB) 休眠枝条韧皮部 5 抽样 5.1 脱毒母本树的抽样 每株均需检测。 5.2 出圃苗木的抽样 采用随机取样方法抽取出圃苗木进行病毒检测。以1万株抽检10株为基数(不足1万株以1万株计), 10万株内(含10万株),每增加1万株增检5株，超过10万株，每增加1万株增检2株。 6 检测方法 6.1 双抗体夹心酶联免疫检测法 (DAS-ELISA检测法) 检测方法见附录A。 6.2 反转录-聚合酶链式反应检测法 (RT-PCR 检测法) 检测方法见附录B. 7 质量要求 7.1 凡酶联免疫检测或RT-PCR 检测呈阳性反应的为带毒苗木。 7.2 脱毒母本树：病毒株允许率为0。 7.3 出圃苗木：病毒株允许率≤3.0%。 3 DB64/ T 829—2013 附 录 A (规范性附录) 双抗体夹心酶联免疫检测法(DAS-ELISA) A.1 溶液配制 所用化学试剂均为分析纯级规格，用水为蒸馏水。 A.1.1 抽提缓冲液 抽提缓冲液的配制见表A.1。 表A.1 抽提缓冲液的配制 药品名称 质量/体积 三羟甲基氨基甲烷(Tris) 60.50 g 氯化钠(NaC1) 8.00 g 聚乙烯吡咯烷酮(PVP),MW40000 20.00 g 聚乙二醇(PEG) 10.00 g 叠氮化钠(NaN?) 2.00 g 吐温-20 (Tween-20) 0.50 g 注：将以上药品依次溶于900mL蒸馏水中，用盐酸将溶液pH值调整到8.2,再用蒸馏水定容至1000mL,4℃下保存， 有效期1年。 A.1.2 洗涤缓冲液 洗涤缓冲液的配制见表A.2。 表A.2 洗涤缓冲液的配制 药品名称 质量/体积 氯化