生物化学课件第五章蛋白质的共价结构.pptVIP

肽键的专一性水解(化学法) 化学法: BrCN, H+, NH2OH, etc 化学法专一性水解 第三十一页，共五十七页。 消化道内几种蛋白酶的专一性 （Phe.Tyr.Trp） （Arg.Lys） （脂肪族） 胰凝乳蛋白酶 胃蛋白酶 弹性蛋白酶 羧肽酶 胰蛋白酶 氨肽酶 羧肽酶 （Phe. Trp） 第三十二页，共五十七页。 泛用酶： 胰蛋白酶（trypsin）； Lys-X, Arg-X (X≠Pro) 胰糜乳蛋白酶（chymotrypsin）；Y-X（Y=Phe,Trp,Tyr; X≠Pro) 嗜热菌蛋白酶（thermolysin）； 木瓜蛋白酶（papain）； X-Y (X=R, K,Q, H, Y) 胃蛋白酶（pepsin）； 枯草杆菌碱性蛋白酶（subtilisin） 专一酶： Lys-X; X-Lys; Arg-X; Glu-X; X-Asp; Pro-X; Asn-X , 商品名：Endoproteinase Asn-C 肽键的专一性水解(酶法) 酶法专一性水解 第三十三页，共五十七页。 氨基酸的鉴定、分离纯化 PTH-AA 氨基酸的确定 第三十四页，共五十七页。 太短在多肽链中次序的决定 资料：N-末端残基H,C-末端残基S; 第一套肽段 第二套肽段 OUS SEO PS WTOU EOVE VERL RLA APS HOWT HO 第三十五页，共五十七页。 借助重叠肽确定肽段次序： 末端残基 H S 末端肽段HOWT APS 或 OUS 第一套肽段：HOWT OUS EOVE RLA PS 第二套肽段：HO WTOU SEO VERL APS 推断全序列: HOWTOUSEOVERLAPS 第三十六页，共五十七页。 第三十七页，共五十七页。 二硫键的断裂：几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的?-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。 第三十八页，共五十七页。 胰岛素 ?-巯基乙醇 碘乙酸 二硫键的断裂 第三十九页，共五十七页。 确定原多肽链重二硫键的位置： 一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。 第四十页，共五十七页。 二硫键的切割与保护 1、过甲酸〔performic acid〕 不可逆 －CH2SO3H 2、还原＋烷基化 不可逆 [ 巯基乙醇，DTT ] ＋ 碘乙酸等 －S-CH2-COOH 二硫键的保护 第四十一页，共五十七页。 第五章 蛋白质的共价结构 第一页，共五十七页。 第二页，共五十七页。 第三页，共五十七页。 第四页，共五十七页。 第五页，共五十七页。 1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质的结构可以分成四个层次: primary structure 一级结构： 氨基酸序列 secondary structure 二级结构： α螺旋，β折叠 tertiary structure 三级结构：所有原子空间位置 quanternary structure 四级结构： 蛋白质多聚体 1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和双硫键的位置。 介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结构的组合）和结构域（在空间上相对独立）这两个层次。