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生物大分子的分离纯化和鉴定;2、植物组织：10小时内置-4 -30℃冰箱储藏备用 3、微生物：胞外产物（如发酵液），低温短时储藏。 胞内产物，则应收集菌体或细胞，制成冻干粉于4℃保存（数月不变质） 除了体液和微生物胞外的某些蛋白质和多肽以外,大多数生物大分子都存在于细胞之内.;蛋白质的分离纯化;2、盐析 高浓度的盐（常用硫酸铵）可以降低蛋白质的溶解度。因 为高浓度盐争夺了蛋白质分子的水膜层，降低了环境中水的相 对浓度，还中和了蛋白质表面的电荷。不同蛋白质因所带电荷 和水化程度不同而在不同的盐浓度下分别沉淀出来。盐的饱和 度由低到高逐次增加，如血清中加入50%饱和度的(NH4)2SO4可使 球蛋白析出，加入100%饱和度(NH4)2SO4可使清蛋白析出，达到 分级分离的目的. 盐析后必须脱盐。 脱盐最常见的方法是透析法，也可以用凝胶层析（葡聚糖凝 胶SephadexG25脱盐）、超过滤技术脱盐。盐析通常与等电点沉 淀法相结合使用。脱盐是否彻底，要经常进行检查。如除去 (NH4)2SO4可用10%BaCl2检查；除去NaCl可用10%AgNO3检查，直到 透析液中检测不出BaSO4或AgCl为止，透析完成。;3、有机溶剂分级法  有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变介质的介电常数，水是高介电常数（20℃时，80），有机溶剂是低介电常数物质（20℃时，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4），因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。这样，蛋白质分子表面的可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐析相似，与蛋白质争夺水化（膜）水，致使蛋白质聚集体的形成并沉淀。 有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操作时溶液的pH值应控制在欲分离蛋白质的等电点附近。;（二）根据分子大小不同的分离方法： 1、透析和超过滤：即利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质（如无机盐、单糖、水）等分开。;2、密度梯度（区带）离心： 蛋白质颗粒在具有密度梯度介质中离心时，每种蛋白质 颗粒降到与自身密度相近???密度梯度时停止不前，各种蛋 白质被分离成各自独立的区带。 3、凝胶过滤（分子筛层析） 根据分子大小来分离蛋白质混合物的最有效的方法之 一。当分子大小不同的混和样品通过装填有高度水化的惰 性多聚体（葡聚糖凝胶Sephadex和琼脂糖凝胶Sepharose） 的层析柱时，比凝胶“网眼”大的蛋白质分子不能进入“网眼” 而被排阻在凝胶颗粒之外，比“网眼”小的分子则进入凝胶 颗粒的内部。这样，由于不同大小的分子所经历的路程不 同而得以分离，大分子先洗下来，小分子后洗下来。;第8页/共15页;（三）根据电荷不同的分离方法： 1、???电泳 2、???离子交换层析 ?（四）根据特异亲和力不同的分离方法——亲和层析;层析技术;（1）吸附层析： 利用吸附剂（固定相）表面对不同组分物理吸附性能的差异 而达到分离的目的。 如 硅胶G薄层层析。 （2）分配层析： 利用各组分在给定的两相中不同的分配系数而得到分离。如 纸层析。 （3）离子交换层析： 利用离子交换剂与试样中不同离子结合吸引力的差异大小不 同而得到分离。常用的交换剂有CM—纤维素（弱酸型阳离子交换 剂）。弱碱型的有阴离子交换剂DEAE—纤维素、改进型的CM— Sephadex和DEAE—Sephadex。 （4）凝胶层析： 利用固定相的孔径对试剂样各分子（分子量大小或体积大 小）的排阻特性差异进行分离。 （5）亲和层析： 利用固定相特定配体与试样各分子特异性结合力（亲和力） 大小不同进行分离。;电泳技术 电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反 的电极移动的现象。 原理： 在一定PH条件下，不同的物质具有不同的等电 点就带不同性质的电荷，因而在电场中它们的移动方 向和移动速度也不同，可使它们分离。 颗粒在电场中移动的速度主要决定于颗粒带电荷 的量，同时受颗粒形状和颗粒相对分子质量的大小的 影响。; 目前，电泳（electrophoresis）方法大致可分为 三类：显微电泳、自由界面电泳（没有支持物）及区带 电泳。以区带电泳应用比较广泛。显微电泳是用显微镜 直接观察细胞等大颗粒物质电泳行为的过程。目前已用 于研究膜结构及癌细胞和正常细胞的差异性等方面。 自由界面电泳是被分离的溶质颗粒经电泳后与缓冲 溶液之间形成界面的电泳过程。利用适当的光学系统可 观察到界面的移动。在电泳过程中，每个移动界面 （峰）相当于某一特定的蛋白质。如：用于血浆蛋白成