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Exp重组质粒的酶切第1页/共12页第2页/共12页二、实验原理?BamHI单切?EcoRI PstI 第3页/共12页三、实验器具、药品器具和材料?1.5ml EP管,移液器及枪头(10、50?l)?恒温水浴、电泳仪、电泳槽?重组质粒pMD18-T第4页/共12页试剂?限制酶: BamHI、EcoRI和PstI?酶切buffer: 10?K、10?H?DNA marker: ?-HindⅢ?琼脂糖,1?TAE, 上样buffer第5页/共12页四、实验步骤1. 酶切反应步骤 ?ddH2O于EP管→10?buffer→质粒DNA→限制酶→混匀,离心5s→37℃, 50?→65℃水浴10? 第6页/共12页(1) 单酶切反应成分ddH2O10? K BufferDNABamHITotal 需量(?l)7.52100.520?BamHI (15U/?l)?组/4人; 30℃, 50? 第7页/共12页(2) 双酶切反应成分ddH2O10? H BufferDNAEcoRIPstI需量(?l)7.52100.250.25?EcoRI PstI (15U/?l)?组/4人; 37℃, 50? 第8页/共12页2. 凝胶电泳检测 ?0.8%Aga,30ml TAE,煮沸?冷却至55℃,2?l EtBr?倒胶,插梳子,凝固20??2?l上样液+样品?100V电泳,观察第9页/共12页酶切失败的可能原因 不全切或基本未切?缓冲体系不合适?酶量过多?样品杂质含量高DNA被降解?痕量DNase第10页/共12页注意事项①吸量要准确②最后加酶③冰上操作④勿触管盖内面⑤EP管盖严第11页/共12页五、作业思考题P140 2、5第12页/共12页感谢观看！EcoRI PstI (H型缓冲液)上次实验提取的重组质粒pMD18-T (Apr)TaKaRa公司生产的?-DNA标准DNA (50ng/?l)分子量, 为HindIII酶切产物,包括8个从125bp到23,130bp的标准DNA碱基对,事实上,125bp条带难以看到 BamHI,10?K Buffer,15 U/?l配制0.8%琼脂糖凝胶(30ml),加20?l EB,酶切样品全部点样,另外取10?l未酶切质粒作对照,100 V电泳,待溴酚蓝移至胶的3/4位置结束电泳; ?-Hind III digest DNA marker (50ng/?l),由于cos末端之间的结合,会影响23k和4.36k的条带,因此,电泳前热处理(60℃,5min),使Marker的电泳图像变得更为清晰北京六一仪器厂生产的?-DNA标准DNA (250ng/?l)分子量, 为HindIII酶切产物,包括7个从560bp到23,130bp的标准DNA碱基对 酶切失败主要表现为两方面: (1) 不完全酶切甚至是DNA基本未发生酶切; 主要原因有: ①缓冲体系不合适,可进行重新酶切; ②酶量加入过多而导致甘油抑制酶活,可将反应体系适当稀释；③DNA样品杂质含量高,可采用稀释酶切或将DNA样品重新抽提后酶切; (2) DNA被降解(不成带状): 主要原因是DNA样品中含有痕量的DNA酶,建议重新抽提除去DNA酶 ①吸样量一定要准确; ②为了不使酶污染而导致浪费,最后才加酶; ③要求在冰上操作,并充分混匀; ④开启Eppendorf管时,手不要接触到管盖内面,以防污染; ⑤样品在37℃与65℃保温时,将离心管盖严,以防水进入管内造成实验失败限制酶酶解中常见的问题和原因: (1) DNA完全没有被限制酶切割: ①限制酶失活; ②DNA不纯,含有SDS、有机溶剂、EDTA等; ③限制酶非最佳反应条件; ④酶切位点被修饰; ⑤DNA上不存在该酶的识别顺序 (2) DNA切割不完全: ①限制酶活性下降或稀释不正确; ②DNA不纯或反应条件不佳; ③酶切位点被修饰; ④部分DNA溶液粘在管壁上; ⑤酶切后DNA黏端退火 (3) DNA片段数目多于理论值: ①限制酶星号活力; ②存在第二种限制酶污染; ③样品DNA中含有其它DNA