- 1、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。。
- 2、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
- 4、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
- 5、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 6、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 7、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
蛋白质顺序测定的基本战略 将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 将肽段分离并测出顺序 专一性裂解 末端氨基酸测定 二硫键拆开 纯蛋白质 当前第30页\共有50页\编于星期六\11点 胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链(最适pH约2,此时二硫键不断开)(在二硫键保持完整的条件下,将蛋白质特异切割成肽段。) 经电泳分离各肽段 用过甲酸断开二硫键,含有-S-S-的肽段带电性质发生变化,转向90℃二次电泳,曾含二硫键的肽段迁移率发生变化 然后同其它方法分析的肽段进行比较,确定二硫键的位置 二硫键位置的确定 当前第31页\共有50页\编于星期六\11点 二硫键位置的确定 对角线电泳 当前第32页\共有50页\编于星期六\11点 Sanger反应 1、 末端分析 ? 二硝基氟苯(DNFB)法 O 2 N F N O 2 + H 2 N C H C R O H N C H C R O O 2 N N O 2 H + H 2 O O 2 N N O 2 H N C H C R O O H + 氨基酸 DNFB N-端氨基酸 DNP衍生物 DNP-氨基酸 末端氨基酸残基的鉴定 N 二硝基苯衍生物 黄色 当前第33页\共有50页\编于星期六\11点 二甲氨基萘磺酰-AA有强荧光,检测灵敏度高 ? 丹磺酰氯(DNS)法 末端氨基酸残基的鉴定 、 末端分析 1 N (DNS-aa) 当前第34页\共有50页\编于星期六\11点 ?苯异硫氰酸酯法(PITC法、Edman降解法) 末端氨基酸残基的鉴定 、 末端分析 1 N —N=C=S + N—CH—COOH H H R PITC —N—C—N—CH—COOH H H R S PTC-氨基酸 pH8.3 苯异硫氰酸酯PITC 当前第35页\共有50页\编于星期六\11点 PITC PTC-肽 当前第36页\共有50页\编于星期六\11点 步骤三、转膜 3 膜的选择:NC,PVDF,尼龙膜 转膜方法:半干转、湿转 转膜确认 当前第1页\共有50页\编于星期六\11点 原料是基础--膜 选择种类 NC PVDF 尼龙膜 选择标准 a.膜与目的蛋白分子的结合能力(也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量),以及膜的孔径(也就是拦截蛋白的大小); b.不影响后续的显色检测(也就是适合用于所选的显色方法,信噪比好); c. 后继实验有其他要求,比如要做蛋白测序或者质谱分析,还要根据不同目的来挑选不同的转移膜 当前第2页\共有50页\编于星期六\11点 膜的选择 当前第3页\共有50页\编于星期六\11点 转移方法 半干转 用滤纸吸buffer来做转移体系的转移方法; 适合转移小分子量的蛋白; 半干转的电流大小是按照面积来算的:1.2mA/cm2, 时间是根据蛋白分子大小定的; 56mA/膜 1h 湿转 将膜、胶、滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的方法; 适合转移大分子量(100KD以上)蛋白; 湿转电流是恒定的,时间也是根据分子量而定; 300mA 1h 当前第4页\共有50页\编于星期六\11点 封闭 +阳极 -阴极 多孔垫片 滤纸 凝胶 膜 滤纸 垫片 2层滤纸 膜(左上角标记) 凝胶(Marker靠左) 2层滤纸 垫片 白色夹板(正极) 黑色夹板(负极) 300mA 1h 56mA /膜 1h 转移操作 当前第5页\共有50页\编于星期六\11点 转膜后确认 丽春红:转膜后直接把纤维素膜浸到丽春红染色液里在摇床上摇,就能把蛋白质染成红色了,肉眼可见.丽春红带负电荷,可以与带正电荷的氨基酸残基结合,同时丽春红也可以与蛋白的非极性区相结合,从而形成红色的条带. 可逆染色:丽春红对蛋白的染色是可逆的,染色后可以用蒸馏水,PBS或其它适当溶液洗去. 与下游WB检测完全兼容,无任何干扰 蛋白质预染Markers 实时监测 分子量参照 当前第6页\共有50页\编于星期六\11点 封 闭 去除非特异结合位点: Blocking Buffer :3%BSA 5% Milk Room Temperature 1 h. 当前第7页\共有50页\编于星期六\11点 一抗的选择 单克隆抗体 多克隆抗体 二抗的选择 HRP,AP,生物素,荧光素,罗丹明标记 注意:抗体的稀释倍数是由底物和待检测蛋白质的丰度决定的, 为了获得最佳实验结果,强烈推荐进行预实验,以确定
您可能关注的文档
最近下载
- 《心理健康讲座》ppt课件(图文).pptx
- 初中英语话剧7-8个人物的剧本.doc VIP
- 鲁教版五四制八年级上册生物 第七单元 第一章 动物的主要类群 练习题(无答案).doc VIP
- [人教版小学五年级上册美术教案.doc VIP
- 《中华人民共和国放射性污染防治法》知识培训.pptx VIP
- 二年级上册劳动技术教案(详).docx VIP
- 第2课 使用数字设备 教案 义务教育人教版信息科技三年级全一册.docx VIP
- DLT5161表格大全(电气装置安装工程质量检验和评定规程).pdf VIP
- 初中数学综合实践活动课教学策略研究.pptx VIP
- 六年级语文上册第二单元教材分析+说课.pptx VIP
文档评论(0)