蛋白质研究技术.pptVIP

蛋白质顺序测定的基本战略 将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 将肽段分离并测出顺序 专一性裂解 末端氨基酸测定 二硫键拆开 纯蛋白质 当前第30页\共有50页\编于星期六\11点 胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链（最适pH约2，此时二硫键不断开）（在二硫键保持完整的条件下，将蛋白质特异切割成肽段。） 经电泳分离各肽段 用过甲酸断开二硫键，含有-S-S-的肽段带电性质发生变化，转向90℃二次电泳，曾含二硫键的肽段迁移率发生变化 然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置 二硫键位置的确定 当前第31页\共有50页\编于星期六\11点 二硫键位置的确定 对角线电泳 当前第32页\共有50页\编于星期六\11点 Sanger反应 1、 末端分析 ? 二硝基氟苯（DNFB）法 O 2 N F N O 2 + H 2 N C H C R O H N C H C R O O 2 N N O 2 H + H 2 O O 2 N N O 2 H N C H C R O O H + 氨基酸 DNFB N-端氨基酸 DNP衍生物 DNP-氨基酸 末端氨基酸残基的鉴定 N 二硝基苯衍生物 黄色 当前第33页\共有50页\编于星期六\11点 二甲氨基萘磺酰-AA有强荧光，检测灵敏度高 ? 丹磺酰氯（DNS）法 末端氨基酸残基的鉴定 、 末端分析 1 N (DNS-aa) 当前第34页\共有50页\编于星期六\11点 ?苯异硫氰酸酯法（PITC法、Edman降解法） 末端氨基酸残基的鉴定 、 末端分析 1 N —N=C=S + N—CH—COOH H H R PITC —N—C—N—CH—COOH H H R S PTC-氨基酸 pH8.3 苯异硫氰酸酯PITC 当前第35页\共有50页\编于星期六\11点 PITC PTC-肽 当前第36页\共有50页\编于星期六\11点 步骤三、转膜 3 膜的选择：NC，PVDF，尼龙膜 转膜方法：半干转、湿转 转膜确认 当前第1页\共有50页\编于星期六\11点 原料是基础--膜 选择种类 NC PVDF 尼龙膜 选择标准 a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）； b.不影响后续的显色检测（也就是适合用于所选的显色方法，信噪比好）； c. 后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜 当前第2页\共有50页\编于星期六\11点 膜的选择 当前第3页\共有50页\编于星期六\11点 转移方法 半干转 用滤纸吸buffer来做转移体系的转移方法； 适合转移小分子量的蛋白； 半干转的电流大小是按照面积来算的：1.2mA/cm2， 时间是根据蛋白分子大小定的； 56mA/膜 1h 湿转 将膜、胶、滤纸整个浸泡在buffer的Tank里转移的方法； 适合转移大分子量（100KD以上）蛋白； 湿转电流是恒定的，时间也是根据分子量而定； 300mA 1h 当前第4页\共有50页\编于星期六\11点 封闭 +阳极 -阴极 多孔垫片 滤纸 凝胶 膜 滤纸 垫片 2层滤纸 膜（左上角标记） 凝胶（Marker靠左） 2层滤纸 垫片 白色夹板（正极） 黑色夹板（负极） 300mA 1h 56mA /膜 1h 转移操作 当前第5页\共有50页\编于星期六\11点 转膜后确认 丽春红：转膜后直接把纤维素膜浸到丽春红染色液里在摇床上摇,就能把蛋白质染成红色了,肉眼可见.丽春红带负电荷,可以与带正电荷的氨基酸残基结合,同时丽春红也可以与蛋白的非极性区相结合,从而形成红色的条带. 可逆染色：丽春红对蛋白的染色是可逆的,染色后可以用蒸馏水,PBS或其它适当溶液洗去. 与下游WB检测完全兼容，无任何干扰 蛋白质预染Markers 实时监测 分子量参照 当前第6页\共有50页\编于星期六\11点 封 闭 去除非特异结合位点： Blocking Buffer ：3%BSA 5% Milk Room Temperature 1 h. 当前第7页\共有50页\编于星期六\11点 一抗的选择 单克隆抗体 多克隆抗体 二抗的选择 HRP，AP，生物素，荧光素，罗丹明标记 注意：抗体的稀释倍数是由底物和待检测蛋白质的丰度决定的， 为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行预实验，以确定