植物遗传转化技术.ppt

存在缺陷 Ti质粒分子量过大，一般在160～240kb，在基因工程中难以操作； 很难找到单一的酶切位点； 生长在培养基上的植物转化细胞产生大量的生长素和分裂素阻止了细胞再生长为整株植物； Ti质粒只能在农杆菌中复制、繁殖而扩增，不能在大肠杆菌中复制。 Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。 第三十页，共七十七页，2022年，8月28日 1、除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物； 2、除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长； 3、除去 Ti 质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度； 4、安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作； 5、安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，使用植物基因的启动子和polyA化信号序列； 6、安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。 Ti 质粒的改造 第三十一页，共七十七页，2022年，8月28日 Ti质粒的改造-去除致瘤基因Onc 由于影响植株再生的直接原因是T-DNA中的Onc基因的致瘤作用，因此，切除其致瘤基因，使成为无毒的质粒，即“卸甲”、“解除”、“缴械”其“武装”的Ti载体，记为Onc-，构建的Onc-载体叫“卸甲载体”。 卸甲载体：构建无毒的Ti质粒载体 例：pGV3850:是从胭脂碱Ti质粒PTIC58衍生而来的 第三十二页，共七十七页，2022年，8月28日 Ti质粒的其他部分 右边界（RB） 胭脂合成酶基因（Nos) pBR322（含AMPr） 左边界（LB） 卸甲载体 第三十三页，共七十七页，2022年，8月28日 中间表达载体 中间载体： 带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒的衍生载体称为”中间载体” 原理：大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合转移的特性 目的：把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的T-DNA引入Ti质粒中。 第三十四页，共七十七页，2022年，8月28日 中间表达载体：是由中间载体（含选择标记）加上能在植物细胞中表达的启动子及目的基因构成，也就是嵌合基因插入中间载体后构成。 嵌合基因（chimeric gene） 就是来自两种或两种以上生物的启动子、结构基因、终止子连接在一起构成基因。 第三十五页，共七十七页，2022年，8月28日 中间表达载体-启动子及调控序列 Ti质粒 Nos、Ocs等基因具有与真核生物启动子类似的TATA盒和CAAT盒，均能在植物细胞中表达，并且无组织特异性。因此，它们成为早期构建嵌合基因的启动子，其中以Nos启动子（pNos）最常用。 CaMV的35s启动子 花椰菜花叶病毒DNA的CaMV的35s启动子能使嵌合的外源基因在植物细胞中表达。 第三十六页，共七十七页，2022年，8月28日 为使优良性状聚集于同一生物体，在生物群体中分离其编码蛋白（酶）的基因，创造出有价值的新物种。 目的基因 第三十七页，共七十七页，2022年，8月28日 中间表达载体-选择标记 供植物转化体的选择标记： 新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ) 卡那霉素抗性基因(kanr) 潮霉素B磷酸转移酶基因，可抗潮霉素(hygr) 氨苄青霉素抗性(Ampr) 四环素抗性(Tcr ) 庆大霉素抗性(Genr) 第三十八页，共七十七页，2022年，8月28日 Cat（氯霉素乙酰移酶基因） Cat也是应用得较多的一种报告基因。它来自细菌转座子Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因的结构基因。 第三十九页，共七十七页，2022年，8月28日 第四十页，共七十七页，2022年，8月28日 植物遗传转化载体系统 转化载体系统 一元载体转化系统 双元载体转化系统 第四十一页，共七十七页，2022年，8月28日 一元载体转化系统 这类载体是中间表达载体与改造后的受体Ti质粒之间，通过同源重组所产生的一种复合型载体。 一元载体系统目前主要有两种载体： 共整合载体 拼接未端载体（split-end vector, SEV） 第四十二页，共七十七页，2022年，8月28日 一元载体转化系统-共整合载体 共整合载体的特点是： 中间表达载体与受体Ti卸甲载体，通过同源重组共整合而构建； 中间表达载体与受体Ti质粒之间同源序列是pBR322 第四十三页，共七十七页，2022年，8月28日 Ti质粒的其他部分 右边界（RB） 胭脂合成酶基因（Nos) pBR322（含AMPr） 左边界（LB） pBR322 vector 目的基因 重组载体 卸甲载体 外源基因插入pGV3850的过程 中间载体 共整合载体 第四十四页，共七十七页，