Odyssey红外激光成像系统蛋白研究的多功能平台.pptxVIP

第1页/共45页Odyssey红外激光成像系统蛋白研究的多功能平台第2页/共45页抗原一抗结合ODYSSEY成像原理INFRARED APD DETECTORINFRAREDLASER DIODEInfrared dye (IRD800, Alexa680)红外荧光标记的二抗 第3页/共45页Odyssey系统的特点准确定量Wide linear dynamic range操作简便,直接检测No film, darkroom, or messy substrates灵敏度高Equal to or better than chemiluminescence多色检测Normalization increases quantification accuracy第4页/共45页Background红外荧光－准确定量SaturationCHEMILUMINESCENCE 动态信号－信号随时间变化 信号不与目标蛋白浓度成比例关系ODYSSEY 静态信号－信号不随时间变化 信号和目标蛋白浓度成比例关系INTENSITY0,00,0TIMETIMELow concentration / signalMedium concentration / signalHigh concentration / signal第5页/共45页红外荧光定量Western－DEMO实验目的检测培养细胞转染外源基因的表达状况实验步骤Odyssey:膜+一抗孵育+荧光标记抗体孵育+Odyssey扫描成像ECL:膜+一抗孵育+酶联二抗孵育+底物显色+ UVP扫描成像第6页/共45页红外荧光定量Western－ DEMOOdyssey结果 ECL结果 Marker S1 S2 S3 S4Marker S1 S2 S3 S4信号强度302 62 30 19信号强度51 20 10 4（Odyssey软件分析结果） 10:4:2:1 稀释 结论Odyssey和ECL的相对灵敏度相差不大Odyssey红外激光成像系统具有更好的线性关系和更精确的定量结果 Odyssey扫描图能同时看到Marker 和目标蛋白，ECL看不到 Marker第7页/共45页Infrared dye (IRD800, Alexa680)膜上抗原一抗结合红外荧光优点－直接检测，操作简便红外标记的二抗 不需要底物不需要底片/暗室信号持久 Odyssey直接扫描第8页/共45页Odyssey VS ECL流程ECLOdyssey1跑胶跑胶2转膜转膜3封闭封闭4结合一抗、洗涤结合一抗、洗涤5结合酶标记二抗、洗涤结合红外染料标记二抗、洗涤，成像6发光试剂盒7暗房曝光成像第9页/共45页Visible FluorophoresPAHsPorphyrinsBiomoleculesNIR Dyes2004006008001000 nmAll othersequencers400-650 nmLI-COR700 - 800 nm红外荧光优点－低背景硝酸纤维, 聚偏氟乙稀（PVDF）,生物分子和尼龙等物质在可见荧光范围内有很高的自身荧光。 第10页/共45页红外荧光 vs 可见荧光膜背景信号红外——背景低、SN更高第11页/共45页红外荧光 VS 化学发光定量线性范围ECLODYSSEYOdyssey成像呈现一个很好的线性（定量准确）第12页/共45页红外荧光 VS 化学发光线性宽的成像效果　Odyssey曝光３０秒曝光１分钟曝光５分钟曝光１０分钟第13页/共45页Odyssey—双色同时检测两套独立激发检测系统700通道：680nm激发 720nm检测800通道：780nm激发 820nm检测800 nm700 nmOverlay第14页/共45页应用一：双色－定量western检测Target proteinAnti-rabbit 800 channelNormalizer targetAnti-mouse 700 channel* Two-color detection requires primary antibodies from different hosts第15页/共45页应用二：双色－ERK的磷酸化EGF-StimulatedNon-StimulatedNon-StimulatedNon-StimulatedEGF-StimulatedEGF-Stimulated800 nm channel700 nm channel700 and 800 nmResults OverlaidAnti-ERKAnti-phospho ERK观察EGF刺激后A431细胞中ERK1 and ERK2 (p44/42