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基因工程WJ的学习资料;第2页/共125页;发荧光的 热带斑马鱼;第4页/共125页;什么是基因工程？;本章学习内容;第7页/共125页;第一节 自然界的基因重组;Transformation;Transduction;Transposition; 操作和改造遗传物质的重要技术--基因工程;Frederick Sanger 1918～ ;第二节 基因工程的常用工具酶;一、限制性内切酶是切割 DNA 的工具;1. 限制性内切酶有哪些类型？;限制性内切酶的命名;2. II 型限制性内切酶如何起作用？; 作用特点;3. 限制性内切酶有什么用途？;λ噬菌体DNA的限制酶酶解;二、DNA 聚合酶可用于合成 DNA; ;三、DNA 连接酶用于 DNA 片段的连接;四、逆转录酶用于合成 cDNA;Terminal deoxynucleotidyl transferase 催化脱氧核糖核苷酸依次添加到 DNA 3,羟基端 聚合反应没有特异性，无需模板 用途： DNA末端添加同聚尾，构建人工粘性末端 末端标记;六、碱性磷酸酶可用来辅助连接反应;第三节 基因工程的常用载体;载体是怎么来的？;一、什么是质粒载体？;复制子决定了质粒拷贝数;早期的质粒载体载体是什么样子？;如何对质粒载体进行改进？;;质粒载体有什么特点和用途？;真核细胞有质粒吗？;二、λ噬菌体有什么特点？;λ噬菌体有导入细胞的效率很高;λ噬菌体有比较大的容量;不同λ噬菌体载体容量不同;常用λ噬菌体有哪些种类？;粘粒载体有更大的容量;粘粒适用于构建基因组文库;三、丝状噬菌体载体是专用的单链载体;四、质粒载体可改造为原核表达载体;1. 启动子具有起始和调节转录的作用;目前常用的是人工改造的启动子;2. SD 序列可决定产物的翻译方式;3. 终止子是转录终止所必需的;五、病毒载体是主要的真核载体;1. 反转录病毒载体;如何构建反转录病毒载体？;重组病毒的包装;反转录病毒载体有什么特点？;2. SV40 病毒载体;利用 SV40 病毒序列可构建穿梭质粒;第四节 基因克隆的过程;一、如何获得目的基因？; 1. PCR 是获得基因最便捷的手段;2. 基因可以人工合成;3. 基因组文库;4. cDNA文库;cDNA 文库特点有什么特点？;如何利用文库筛选基因？;噬菌斑杂交;二、DNA 体外重组;1. 如何进行粘端连接？;碱性磷酸酶处理可防止载体回连;双酶切是连接的首选;2. 如何进行平端连接？;人工接头与同聚物尾可提高平端连接效率;PCR 产物有特殊的连接方式;三、如何将重组子导入宿主细胞？;1. 质粒 DNA 转化大肠杆菌;2. 真核细胞的转染;3. λ噬菌体感染宿主细菌;四、需要经筛选才能获得重组子;插入失活与插入表达;利用 lacZ 基因的蓝白筛选是最便捷的方式;第五节 外源基因的表达;一、如何利用原核细胞表达外源基因？;原核系统有哪些表达方式？;1. 成熟型表达载体;2. 融合型表达载体;融合蛋白纯化;3. 分泌型表达载体;过量表达的蛋白可形成包含体;二、如何利用真核系统表达外源基因;哺乳动物系统的表达方式－－瞬时表达;哺乳动物系统的表达方式－－稳定表达;如何进行表达产物的检测？; 转基因与基因打靶;一、转基因技术;著名的转基因小鼠试验;转基因生物的意义是什么？;转基因动物的基本流程;转基因动物的关键步骤有哪些？;上游—基因改造和载体构建;中游—基因转移和胚胎移植;DNA显微注射法;DNA 显微注射法有什么特点？;显微注射法的流程示意图;胚胎干细胞法;胚胎干细胞法的流程示意图;胚胎干细胞法有什么特点？;下游—基因检测与筛选;基因转移鼠纯合鼠系的建立; 转基因动物有什么用途？;动物的克隆;二、基因打靶;如何进行基因打靶？;如何构建和筛选打靶载体？;如何获得基因敲除小鼠？;也可利用 RNA 干扰进行基因敲除; RNA 干扰;RNA 干扰是 dsRNA 导致的基因沉默;RNAi 现象在真核生物中广泛存在;microRNA 是基因表达的负调控机制;利用 RNAi 可以进行基因敲除;siRNA 与 shRNA;如何设计 siRNA？;如何设计 shRNA 表达载体？;本章的主要内容是什么？;本章的主要内容是什么？;谢谢观看！