chap原核生物分子克隆的宿主和载体系统.pptxVIP

chap原核生物分子克隆的宿主和载体系统第1页/共65页第2页/共65页第一节 应用广泛的细菌宿主一、E. coli K12 的生物学革兰氏阴性细菌没有核膜和染色体一个环状双链DNA分子，有一个复制起点细胞中能维持质粒DNA的复制生活周期较短，20min分裂一次能在发酵罐中高密度生长能在平板上培养出单克隆第3页/共65页二、乳糖操纵子A) lac operon结构以及表达特性lac I: 乳糖阻遏蛋白基因Plac :乳糖代谢结构基因的启动子PI : 阻遏蛋白基因的启动子CAP：代谢激活蛋白结合位点lac Z: β -gallactosidase (β-半乳糖苷酶，水解乳糖形成半乳糖和葡萄糖）lac Y: lactose permease（半乳糖苷透性酶，运送乳糖透过细菌的细胞壁)lac A: transacetylase（半乳糖苷乙酰转移酶，去除由半乳糖苷透性酶吸收的有毒的硫代半乳糖苷thiogalactoside)第4页/共65页 阻遏蛋白四聚体不仅能被别乳糖结合，也能被与别乳糖结构类似的物质如IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖）结合，这种能高效诱导酶的合成，但又不被所诱导的酶分解的分子，称为安慰性诱导物第5页/共65页二、乳糖操纵子利用β-半乳糖苷酶及其基因β-半乳糖苷酶能分解乳糖的类似物X-gal形成蓝色物质，可用此反应来检测细胞中β-半乳糖苷酶的活性。第6页/共65页诱导剂IPTGα-肽段分解X-gal产物呈现蓝色β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15a-互补显色反应（蓝白斑筛选）lacZ -iPOβ-半乳糖苷酶-调控蛋白分解半乳糖第7页/共65页a-互补显色反应（蓝白斑筛选）总结细菌菌株野生型突变体（Lac Z-基因）突变体+无外源片段插入质粒（ Lac Z-+ Lac Z’）突变体+有外源片段插入质粒（ Lac Z-） Lac Z 蛋白有无（仅有ω片段）有（ω+α片段）无（仅有ω片段）底物X-gal分解情况蓝色菌落白色菌落蓝色菌落白色菌落抗生素抗性无无有有第8页/共65页第二节 质粒载体一、质粒的基本生物学特征质粒是染色体外稳定遗传的复制体，其特点共价闭环，双链DNA分子。大都数质粒具有复制原点，能独立进行复制，不依赖寄主的细胞复制周期。质粒第9页/共65页第二节 质粒载体质粒通常赋予寄主一些表型特征，如抗生素抗性等。选择性标记(selectable marker):由于质粒携带的基因，可供实验室条件下进行选择的一些标记。如抗性，营养元素的利用等。显性质粒与隐性质粒.第10页/共65页第二节 质粒载体二、质粒的大小和拷贝数相对分子量从 1kb到250kb不等。分子量较小的适合实验室利用拷贝数 严谨型:少数拷贝存在于细胞中（1~几个） 松弛型:多个拷贝存在于细胞中（≥10） 严谨型与松弛型是相对的。第11页/共65页三、调节拷贝数的机理(质粒的复制，补充知识)Ropdimer（1）、反义RNA进行调控的机制（plasmid Col E1 ）PRNAIIRNA IIA、在复制起点处， RNA II（长555个碱基）与质粒DNA形成RNA-DNA复合物，RNA酶H的降解RNA II ，露出3’自由羟基，质粒复制起始。第12页/共65页RopdimerPRNAIIRNA IIB、 如果RNA I和RNA II形成双链RNA螺旋，RNA酶H不能降解RNA II，复制不能进行。第13页/共65页C、 当质粒的浓度比较高的时，RNA I和RNA II形成双链RNA螺旋，使质粒的复制不能起始。D 、 当质粒的比较低时，RNA II与质粒DNA形成RNA-DNA复合物，RNA酶H降解RNA II 质粒复制起始。E、突变RNA I或去除Rop基因导致质粒的拷贝数增加。第14页/共65页(2 )关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理（ pS101质粒） A 复制原点区域含有3～7拷贝的长度为17～22bp的重复区域，R1、R2、R3等。第15页/共65页(2 )关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理 B、复制原点附近有一个编码基因repA,编码RepA蛋白。 RepA是双功能的蛋白： 与复制原点区域的重复序列结合，起始DNA的合成；与自身基因的启动子结合，抑制自身的转录。第16页/共65页(2 )关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理质粒拷贝数由RepA蛋白浓度和质粒自身的浓度进行调节。 如果质粒拷贝数高， RepA蛋白与自身的启动子区域结合，抑制转录，RepA蛋白合成受阻，DNA的复制受到抑制。RepA蛋白通过结合到两个质粒的重复序列把它们连接起来，避免复制起始。 细胞分裂后，拷贝数和RepA蛋白的浓度降低， RepA蛋白自身合成增加，结合到重复区域起始DNA的合成 。第17页/共65页问题：在寄主复制后，质粒是如何分配到子细胞中？ P