高中生物：PCR引物设计原则的5个要点.docx

PCR引物设计原则的5个要点 PCR引物是人工合成的两段寡核苷酸。一个与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补， 另—个与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。 PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。引物是PCR特异性反应的关键。 引物设计要点（3）? 碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。否则引物自身会折叠成发夹结构或二聚体，从而影响引物与模板的复性结合。a、发夹结构（Hairpin） 自身互补? b??二聚体（Dimer） 两个引物间互补 引物设计要点（4） a ）引物的5端可以修饰，而3端不可修饰 b?）引物的5 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。 c ）引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。在引物的5`端连接一对限制酶的识别序列，这样便于目的基因连接到载体上。 引 物设计要点（5）退火温度高，扩增特异性强；退火温度低，扩增效率高。原因是：如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，使DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的。(2020·江苏卷)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图所示(以EcoR Ⅰ酶切为例)。请据图回答问题： (3) 若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是______(从引物①②③④中选择，填编号)。 答案：②④