1HNMR对烟草甲虫蛀蚀款冬花前后化学成分的变化研究❋.docx

? ? 1HNMR对烟草甲虫蛀蚀款冬花前后化学成分的变化研究? ? ? 徐 博， 宋平平， 吴 翠， 李卓俊， 巢志茂△ (1.中国中医科学院中药研究所， 北京 100700；2.国家中药材产业技术体系贮藏与包装岗位， 北京 100700) 中药款冬花为菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾，性辛、温，味微苦，归肺经，具有润肺下气、止咳化痰的功效，常用于治疗新久咳嗽、喘咳痰多等症[1]。与紫菀组成药对治疗咳嗽气喘、肺纤维化[2-4]，与其他中药组成咳喘宁胶囊提高机体抗氧化损伤的能力[5]；与射干等组成射干麻黄汤治疗儿童哮喘发作[6]，在秋梨膏、百花丸中也有款冬花[7]。目前，在款冬花中已发现的成分有黄酮类、倍半萜类、三萜类、生物碱类、甾醇类及挥发油等[8，9]，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗血小板活化因子等活性[10，11]。款冬花应用历史悠久，分布广泛，主产区有河北晋州、山西长治[12]、陕西铜仁等地，以河北产款冬花质量最佳[13]。 药材中夹杂活虫或虫卵，在适宜的温湿度下，极易发生虫蛀现象[14，15]。款冬花是容易遭受虫害的中药材之一，通常发生在每年的5～10月份[16]。一旦遭受虫蛀，轻者表面出现虫洞，严重者变为粉末，并出现大量的害虫排泄物、残体及药末粉渣等。虫蛀后款冬酮的含量是否发生变化，虫蛀对款冬花其他化学成分的影响，如何鉴定款冬花是否虫蛀等，目前均未见报道。 近年来，1H NMR在中药质量分析领域有了广泛的应用[17，18]，与高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)、气相色谱法(gas chromatography，GC)等相比，不需要复杂的前期色谱分离或衍生化，将之与多元统计相结合已逐渐用于中药材的真伪、产地、品种鉴别等研究[19]。本研究将1H NMR与多元统计相结合，对款冬花虫蛀后的化学成分变化进行了研究和讨论，为鉴定虫蛀款冬花建立了判别方法，并为研究虫蛀对中药材质量的影响提供了思路。 1 材料 AVANCE Ⅱ 400 MHz型核磁共振仪(德国布鲁克公司)，DFT-50A型手提式高速粉碎机(温岭市林大机械有限公司)，Ohaus CP224C型电子天平(奥豪斯(上海)仪器有限公司)，KQ-100E型超声波清洗器(100 W，40 kHz，昆山市超声仪器有限公司)，DK-98-Ⅱ型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)，分析级甲醇(北京化工厂)，D2O、CD3OD(SIGMA)，CD3OD含0.03%三甲基硅基(trimethylsilyl，TMS)。 款冬花由陕西榆林清阳中药材种植基地李永亮提供。部分款冬花样品经烟草甲虫蛀蚀后，出现了明显的虫蛀现象。中国中医科学院中药研究所巢志茂研究员鉴定样品为菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾，蛀虫为鞘翅目烟草甲虫Lasiodermaserricorne(Fabricius)。 2 方法 2.1 样品制备 本实验的研究对象分为三种：第一种是质量合格、未被虫蛀的款冬花，粉碎过5号筛，称为未虫蛀款冬花；第二种是被烟草甲虫蛀蚀后的款冬花，粉碎过5号筛，称为虫蛀款冬花；第三种是款冬花被烟草甲虫蛀蚀后剔除蛀虫，过5号筛获得的烟草甲虫排泄物，称为排泄物。 分别精密称取样品粉末1.0 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇密塞，称定重量，超声30 min(100 W，40 kHz)，静置，冷却至室温，补足失重，摇匀过滤，50 ℃减压浓缩得提取物。提取物以D2O氘代后加入1.0 mL CD3OD，超声溶解，0.45 μm微孔滤膜过滤，取0.8 mL续滤液置于核磁管中以供测试。以上样品分别平行制备3份。 2.2 1H NMR测定 将2.1项下制得的样品溶液置于核磁共振波谱仪中进行1H NMR图谱采集。采集频率400 MHz，傅里叶变换0.122 Hz，脉冲序列zg30，脉冲间隔1.00 s，温度294.7 K，采样时间域66 k，采样时间4.09 s，扫描次数16次，谱宽8012 Hz。TMS为内标，CD3OD锁场。 2.3 1H NMR图谱处理及数据分析 将2.2项下采集的数据导入MestReNova软件(Version 9.0.1，Mestrelab Research SL，西班牙)中，相位自动修正、基线调整，以内标物TMS为基准校正化学位移。对δ8.00～0.00区间以每0.04 ppm作为积分单元进行分段积分，积分中除去CD3OD溶剂峰δ3.31～3.35及水峰δ4.70～5.10。分别将各段的积分面积基于峰面积进行归一化处理，从而得到化学位移积分段与积分值对应的数据矩阵。将数据矩阵导入SIMCA-p 13.0软件(Umetrics，Sweden)