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苯磺酸氨氯地平血浆生物样品检测方法的改进 苯磺酸氨基丙烯酸酯是一种新型抗剂二羟吡啶钙离子抗剂。对血管的选择性很高。主要用于周长手术，也可扩张冠状动脉和肾脏动脉。该药物适用于各型高血压的治疗,也可用于稳定型心绞痛患者。目前,已有多篇文献报道苯磺酸氨氯地平血浆生物样品检测方法,主要包括高效液相色谱紫外检测(HPLC-UV) 材料和方法 药物和试剂 结果 1 内源性基质的提取回收率 结果表明,不同的碱化剂对提取回收率存在影响,但对基质效应影响甚微。图2A表明饱和碳酸氢钠和碳酸钠对基质效应无明显影响,但在饱和碳酸钠条件下,分析物提取回收率更高。由图2B可知,饱和碳酸钠不同用量对提取回收率有一定的影响,当碱化剂的用量从40μL增加至80μL后,高浓度质控样品氨氯地平提取回收率从58%升高至72%,但饱和碳酸钠不同用量对基质效应影响没有显著差异(图2C)。不同萃取溶剂的提取回收率与基质效应也存在明显差别,结果见图2D。正己烷萃取处理的血浆样品基质效应最低,但其提取回收率仅为25%。与乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚相比,甲基叔丁基醚可明显改善基质效应,且具有较高的提取回收率。此外,萃取时间不会明显影响基质效应(图2E)与提取回收率(图2F)。改变色谱分离条件可显著降低基质效应(图2G)。采用等度洗脱方式,低、中、高浓度质控样品基质因子分别为96%、79%和72%,采用梯度洗脱方式低、中、高浓度基质因子分别为94%、96%和94%提示血浆基质效应可通过改变色谱分离条件实现。 如图3所示,在等度洗脱条件下,分析物的保留时间为1.4 min。柱后灌注的结果表明在分析物保留时间前后质谱响应信号均被抑制,且在2.5 min处仍存在明显的信号抑制,表明血浆中内源性基质对质谱信号存在显著的影响。改用梯度洗脱分析物的保留时间延长至1.7 min,但峰形明显改善。比较等度洗脱与梯度洗脱模式下定量下限信噪比,检测灵敏度提高2.5倍。此外,影响基质效应的内源性可与分析物实现分离,在此条件下的分析物保留时间处无质谱信号抑制现象。 2 方法学的检验 2.1 专业 分析物和内标的保留时间均约为1.7 min,空白血浆样品的色谱图中没有出现干扰峰,在本条件下待测物的分离与测定不受影响。 2.2 标准曲线和定量限 结果表明,苯磺酸氨氯地平在0.1~20.0μg?L 2.3 剩余效果 在最高浓度校正标样进样分析完成后,进样分析一个空白样品,空白样品色谱图中未发现分析物与内标残留,本方法不存在残留效应。 2.4 准确度和精密度 苯磺酸氨氯地平定量下限、低、中、高浓度质控样品的批内与批间精密度和准确度相对标准差(RSD)均小于15%,定量下限相对偏差(|RE|)在20%内,低、中、高浓度质控样品|RE|11%。 2.5 加收率验证 苯磺酸氨氯地平回收率在83.5%~88.2%之间,内标回收率为88.3%。低、中、高浓度苯磺酸氨氯地平和内标的基质因子分别为(93.9±1.8)%,(95.8±4.9)%,(93.9±1.5)%和(97.9±5.3)%。 2.6 稳定性 2.7 交叉干扰 3 人体药代动力学研究与生物等效评估 药代动力学参数结果见表1。AUC 综上所述,受试制剂与参比制剂具有生物等效性,受试制剂与参比制剂为生物等效制剂。 内源性基质的选择 在人体生物等效性或临床药代动力学试验中,LC-MS/MS技术被广泛应用,而基质效应也是检测过程中不可忽视的问题 目前常用的样品前处理方法包括蛋白沉淀,液液萃取和固相萃取等。蛋白沉淀法 由于氨氯地平分子式中有两个酯基团,遇强碱(如氢氧化钠)不稳定。参考相关文献,本研究考察了饱和碳酸钠和碳酸氢钠两种弱碱对提取回收率和基质效应的影响。在饱和碳酸钠作用下,血浆中氨氯地平更多以分子形式存在,有利于氨氯地平从血浆样品向有机相的转移,提高提取回收率。饱和碳酸钠和碳酸氢钠对基质效应影响没有显著差异。 本实验改变样品前处理方法与选用同位素内标可改善相对基质效应、提高实验检测的精密度,但绝对基质效应与准确度都不能得到改善 目前,评价基质效应的方法主要有柱后灌注法和提取后加入法。柱后灌注法能直观地显示内源性基质对待测物在色谱保留时间处质谱检测信号响应的影响,为提取后加入法评价基质效应起到很好的补充作用。本实验采用柱后灌注法证明血浆中内源性基质在等度洗脱的条件下对氨氯地平分析物色谱保留前后均存在明显抑制情况,提示可通过改变色谱分离条件改善血浆中内源性基质对质谱检测信号的影响。 本研究采用改变色谱条件由原来的等度洗脱转为梯度洗脱,利用色谱柱分离内源性干扰物和分析物,解决了本方法中存在的基质效应问题。在分析开始,利用高水相将极性较大、保留较弱的内源性物质先洗脱;再缓慢升至高有机相,让分析物在此过程中被洗脱;分析物洗脱后再将高有机相维持0.7 min,使得极性较小的