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金属-内酰胺酶检测方法的探讨 博曼运动是常见的临床疾病之一。近年来随着碳青霉烯类药物的广泛使用,碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌(CRAB)的分离率逐年增高 1 u3000材料 1.1菌株来源收集2010年1月至2012年12月从昆山市中医院与昆山市第一人民医院两所三级医院门诊和住院患者中分离出的非重复、耐亚胺培南鲍曼不动杆菌104株,采集的标本包括痰液、创面分泌 物、血液、渗出液、支 气管灌洗 液等。质控菌株为铜绿假单胞菌(ATCCu300027853)。 1.2仪器与试剂Powerpacu3000Basic基础电泳仪及GelDocu3000system全自动凝胶成像 系统为Bio-Rad产品,亚胺培南 纸片(10μg,IMP)购自英国Oxoid公司,MH(Muelleru3000Hinton)培养基购自广州迪景微生物科技有限公司,分析纯EDTA购自上海试剂总厂。 1.3u3000引物系列u3000根据参考文献[7]设计针对IMP-1及 VIM-1的引物,由上海生工合成,金属酶IMP-1引物序列 为5′-TGAGCAu3000AGTu3000TATu3000CTGu3000TATu3000TC-3′;5′-TTAu3000GTTu3000GCTu3000TGGTTTu3000TGAu3000TG-3′;金属酶VIM-1引物序列 为5′-TTAu3000TGGAGCu3000AGCu3000AACu3000CGAu3000TGT-3′;5′-CAAu3000AAGu3000TCCu3000CGCu3000TCCAACu3000GA-3′;SanPrep柱式PCR产物纯化 试剂盒购 自上海生工生物公司,由上海生工生物公司进行核酸测序。 1.4u3000方法 1.4.1金属酶基因的检测u3000模板 采用煮沸 法制备。PCR反应体系25μL,包括上下游引物各1μL,2×Taqu3000PCRu3000MasterMixu300012.5μL,DNA模板2.0μL,Water,nuclease-freeu30008.5μL。PCR反应条件为95℃预变性5min,95℃变性30s,52℃退火30s,72℃延伸1 min,共30个循环;最后72℃延伸10min。PCR扩增产物用2.0%凝胶电泳,紫外灯下观察结果,并于凝胶成像系统上拍照。PCR产物的纯化和测序:PCR扩增产物用PCR产物纯化试剂盒(上海生工生物公司)纯化,由上海生工公司完成测序,结果在Genbank数据库中 进行序列 比对分析。 1.4.2金属酶表型筛选试验EDTA-Na 1.5判断标准加了EDTA的IPM纸片产生的抑菌圈比单纯的IPM纸片产生的抑菌圈直径大于或等于7mm为产金属酶株 2 u3000eb-pcr法测序结果为imp-1型金属酶 2.1金属酶基因型检测应用PCR法,在104株对碳青霉烯类抗菌药物耐药的鲍曼不动杆菌中检出IMP-l型金属酶阳性株21株,且各PCR产物电泳 条带位置 皆完全一 致,未检出VIM-1型金属酶阳性株。随机选择部分IMP-l阳性株经标准产物纯化后送上海生工 公司完成 测序,测序结果 与blaIMP-1基因序列完全一致,从而证实 为为IMP-1型金属酶。部 分电泳图见图1。 2.2u3000EDTA纸片增效 法u3000从临 床分离的104株待测菌 中,EDTA纸片增效试验阳性24株,加EDTA后抑菌圈直径比不加EDTA≥7mm,提示有可能产生金属酶见图2(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。 2.3表型初筛试验的结果与PCR结果的比较应用PCR方法,在104株受试菌中检出MBL基因阳性菌21株;EDTA纸片增效法检测出24株阳性菌 株,其中有4株PCR结果为阴性。对比PCR实验结果,该方法的敏感度为95.2%,特异度为95.1%,提示本法与PCR法有较好的相关性。 3 pcr法检测mbl基因 MBL是一类需要金属离子协助才能发挥催化活性的一类广谱β-内酰胺酶,具有广泛水解包括碳青霉烯类在内的β-内酰胺类抗菌药物的能力,而且对常用的β-内酰胺酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦 敏感度差。产MBL的鲍曼不 动杆菌能水解包括第三、第四代头孢菌素类及碳青霉烯类抗菌药物,比非产酶碳青霉烯耐药菌株多重耐药情况更加严重,对临床抗感染治疗构成严重的威胁 目前国内外利用PCR技术检测MBL被认为是最为准确的方法 本研究根据参考文献[6,12]选择EDTA实验浓度为750μg/4μL,从104株待测菌种筛选出MBL表型阳性菌共24株(阳性率为23.0%)。该24株菌株经PCR法证实其 中20株MBL基因阳性,且均为IMP-Ⅰ型MBL。MBL阳性的菌株抑菌圈直径扩大7~12mm(平均8.38mm),MBL阴性的菌株抑菌圈直径则扩大1~6mm(平均4.2