不同内型哮喘小鼠模型中的小气道功能研究及其机制初探.docxVIP

? ? 不同内型哮喘小鼠模型中的小气道功能研究及其机制初探 ? ? 薛艺抒 傅强 包婺平 郝慧娟 张旻 支气管哮喘(以下简称哮喘)是以气道慢性炎症、气道高反应性及气道重塑为主要特征的异质性疾病，根据不同内型及个体化治疗的目的，可将哮喘分为Type2(T2)型哮喘和非T2型哮喘。越来越多的研究发现，小气道功能的异常存在于不同严重程度的哮喘患者[1-3]；我们的临床研究也发现小气道功能异常者的激发试验阳性率明显增高[4]。呼吸描记图末端的减慢被认为是与小气道的气流阻塞有关的最早变化，因此，肺功能中的变量，如用力呼气50%时的瞬时流速(Forced expiratory flow at 50% of Forced Vital Capacity[FVC]，FEF50)、用力呼气75%时的瞬时流速(Forced expiratory flow at 75% of FVC，FEF75)和最大呼气中段流量 (Forced expiratory flow between 25% and 75% FVC，MMEF) 常被用于预测人类小气道功能障碍[5]。然而，在动物哮喘模型中哮喘中小气道功能障碍的观察和研究仍缺乏。通过建立两种不同内型的哮喘模型，本文检测小鼠的小气道功能，并分析其与气道炎症、气道反应性、气道重塑的相关性，为小气道功能障碍在动物哮喘模型中的作用机制提供依据。 资料与方法 一、 材料 C57BL/6小鼠(无特殊病原体级，雄性，5～6周龄，体重18～20g)购自上海吉辉实验动物有限公司，动物合格证号：SCXK(沪)2017-0012，饲养于上海交通大学附属第一人民医院实验动物中心内。饲养环境温度21℃至25℃，湿度40%至60%，自由喂养水和食物(不含OVA)，采用12小时为周期的光-暗循环。所有处理流程和实验操作严格按照上海交通大学附属第一人民医院动物研究伦理委员会的规定执行(伦理批号: 2019-A011-01)。舒泰50(Virbac S.A., France)，拜特速眠新(拜特生物科技研究所有限公司，长沙)，苏木素-伊红染色试剂盒(谷歌生物科技，武汉)；卵清蛋白 ( OVA ) ( grade VⅡ, Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo. , USA) ， 小鼠IL-4、IL-5、IL-17A,、TNF-α ELISA试剂盒(ANOGEN, Ontario, Canada)，小鼠IL-13 ELISA试剂盒(Invitrogen, California, USA)。 二、方法 1 两种内型哮喘模型建立 将C57BL/6小鼠随机分为3组，每组6只。T2型哮喘模型(OVA组)：在第0天和第7天进行卵清蛋白(ovalbumin，OVA)(1mg/kg)+明矾(体积同OVA)腹腔注射致敏小鼠，从第14天至第22天，隔天以PBS配制5% OVA雾化吸入30分钟，并在休息30分钟后吸入空气2小时；非T2型哮喘模型(OVA+ozone组)：其余操作同OVA组，每次OVA雾化结束休息30分钟后，吸入2.5 ppm的臭氧2小时；对照组(Control组)：在第0天和第7天进行PBS腹腔注射，从第14天开始隔天PBS雾化吸入30分钟，随后空气吸入2小时至第22天。 2 小鼠肺功能检测 最后一次臭氧暴露后24小时，以舒泰50(25mg/kg)和拜特速眠新(10mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，确认其完全昏睡且痛觉丧失后，将小鼠固定于泡沫操作板上，剪开颈部皮肤后钝性分离周围组织，充分暴露气管，预先将一生理盐水浸湿的结扎线置于气管下，随后在甲状软骨下的环状软骨上沿气管横径剪一小口，将气管插管插入气管中，将结扎线打结，固定气管插管。连接小鼠的气管插管至EMMS eDacq FM(模拟强迫振荡)系统体积描记器上的接头，根据EMMS数据采集系统eDacq软件中预设的程序，模拟经典的临床肺活量测定法检测小鼠大、小气道功能。该系统计算的参数包括用力肺活量(Forced Expiratory Volume，FVC)和呼气中期流量。其中EF50、FEF75、MMEF提示小气道功能。 3 小鼠气道反应性检测 随后进行有创的气道阻力与顺应性检测。将小鼠置入EMMS RC系统的体积描记器中，采用微型通气系统维持辅助通气，控制通气频率为180次/分，潮气量为210μl，将气管插管导管与EMMS RC系统呼吸流量测定仪和压力传感器连接。eDacq软件自动记录流速的变化与压力的变化，并计算气道阻力(RL)。与传感器连接后，待小鼠呼吸平稳后通过雾化给药系统吸入10μl PBS(给药时间30秒)，停止雾化后RL的检测与记录启动，雾化PBS后的3分钟所记录的RL的均值即为激发前的基础值，随后逐次吸入递增浓度(4，8，16，32，64，128和256mg/mL