不同产地黄芩主要化学成分含量及抗肿瘤活性比较研究.docxVIP

? ? 不同产地黄芩主要化学成分含量及抗肿瘤活性比较研究 ? ? 房佳敏，曾伟民，张彦龙 （黑龙江大学生命科学学院/黑龙江省普通高校微生物重点实验室，哈尔滨 150080） 0 引言 黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis）干燥的根，具有清热燥湿、泻火解毒等功效[1]。在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版）》中医治疗方案中[2]，推荐使用中药及中成药明确标注黄芩的配方和用量，双黄连口服液、清肺排毒汤中，黄芩是重要的原材料[3]。现阶段，黄芩在国内的需求量极大，也是出口到国外最多的药材之一[4]。 黄芩主产于黑龙江、辽宁、内蒙古、河北、河南、甘肃、陕西、山西、山东、四川等地[5]，目前，多以温带、热带等地区的黄芩为研究对象，而寒带地区的黄芩未见详细的阐述。黑龙江为寒带地区的代表，因具有独特地理环境及气候，所产黄芩的化学成分含量也较高。据报道，黑龙江省种植的黄芩15～16 t鲜品可提取1 t黄芩苷，而其他地区需要18～19 t左右提取1 t黄芩苷。黄酮类化学成分是黄芩中主要的活性成分，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素4种化学成分含量较高[6-8]。黄芩苷具有抗菌消炎[9-10]、降转氨酶[11]的作用，汉黄芩苷可以抑制癌细胞增殖[12-13]及转移[14]，黄芩素能够抑制多种细菌生长[15-16]，汉黄芩素具有抗癌[17-18]与利尿[19]的作用。黄芩的质量取决于活性成分的含量，且作为主要的参考指标[20]。肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，肺癌在全世界范围内的死亡率一直较高。已有研究证明，黄芩提取物是可以通过诱导肺癌细胞增殖、凋亡发挥抗肿瘤的作用，其作用机制为诱导细胞增殖、阻断细胞周期、清除癌细胞自由基，抑制肺癌的转移从而达到抑制NF-kB的活性[21]。 本实验采用HPLC技术测定黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素4种化学成分的含量，采用CCK-8试验探讨不同产地黄芩对肺癌细胞增殖的影响，分析不同产地黄芩中主要化学成分及抗肿瘤活性的区别，以期为寒地黄芩的开发及合理利用药用资源提供依据。 1 材料与方法 1.1 实验时间、地点 实验于2020年11月—2020年1月在黑龙江大学生命科学学院211实验室进行。 1.2 仪器与试药 岛津LC-20A型高效液相色谱仪，岛津SPD-20A型紫外可变波长检测器，7725i手动进样器昆山KQ-500TDB型超声波清洗器，Milli-Q超纯水机，ML-T电子分析天平。 黄芩苷对照品（批号21967-41-9）、汉黄芩苷对照品（批号51059-44-0）、黄芩素对照品（批号491-67-8）、汉黄芩素对照品（批号632-85-9）均购自于南通飞宇公司，纯度均大于98%。甲醇、甲酸、乙醇、丙酮均为分析纯，购自于天津市富宇精细化工有限公司。山东、山西、甘肃3个产地的黄芩样品购自于豪州市盟桥药业有限公司，黑龙江的黄芩由黑龙江省勃利县海林药业公司提供。A549肺癌细胞系购自上海中科院细胞库，Cell Counting Kit-8试剂盒购置于北京碧云天公司。 4种不同产地的黄芩样品见表1，经鉴定为唇形科植物黄芩干燥的根，黄芩样品存放于阴凉干燥处，备用。 表1 黄芩样品 1.3 实验方法 1.3.1 色谱条件 Diamonsil-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5 μm）；检测波长274 nm；柱温40℃；流速0.8 mL/min，进样量20 μL；流动相为乙腈（B）-0.1%甲酸水溶液（A），梯度洗脱见表2。 表2 乙腈B梯度洗脱顺序 1.3.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品0.0075 g、汉黄芩苷0.0025 g、黄芩素0.0010 g、汉黄芩素0.0005 g，放置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度线，即得混合对照品溶液。 1.3.3 供试品溶液的制备 （1）制备供试品溶剂的筛选。目前多用乙醇、甲醇、丙酮进行黄芩样品的提取[22]。本研究选用70%乙醇、80%甲醇和60%丙酮对黄芩样品进行初筛，筛选出对4种成分提取效果较好的溶剂。 （2）供试品溶液的制备。精密称取黄芩粉末0.5 g，加入1.3.3（1）筛选出的溶剂40 mL于圆底烧瓶中，加热回流3 h，将其放冷，过滤，滤液置于100 mL容量瓶中，漏斗以及圆底烧瓶的残渣用1.3.3（1）筛选出的溶剂分次冲洗干净，洗液流入同一容量瓶内，最后加入1.3.3（1）筛选出的溶剂至刻度线，摇匀即得供试品溶液。 1.3.4 A549肺癌细胞培养 将A549细胞放置于RPMI-1640培养基中，37℃下在湿润的CO2培养箱中（5% CO2，95%空气）培养。 1.3.5 CCK-8试验 Cell Counting Kit-8试剂盒用于检测各产地黄芩抑制肺癌细胞的增殖。将96孔板中加入密度为5×