不同培养液对大菱鲆致病性纤毛虫-贪食迈阿密虫种群增长及复壮毒力的影响.docxVIP

? ? 不同培养液对大菱鲆致病性纤毛虫 贪食迈阿密虫种群增长及复壮毒力的影响 ? ? 黄智慧 王庆敏 马爱军 郭晓丽 (1 中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室，山东省海洋渔业生物技术与遗传育种重点实验室，青岛市海水鱼类种子工程与生物技术重点实验室，山东青岛 266071； 2 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋生物学与生物技术功能实验室，山东青岛 266071) 海洋纤毛虫在微生物食物环中占据重要而又特殊的地位，也是引发赤潮和养殖动物病害的常见种，从而成为人们日益关注的对象。盾纤毛虫隶属于纤毛门(Ciliophora)、寡膜纲(Oligohymenophorea)、盾纤目(Scuticociliatida)[1]。该类纤毛虫通常自由生活在海水中，但在一些情况下，如鱼体受伤、环境恶化等，可引起海水养殖动物感染，纤毛虫表现为寄生性，以宿主细胞或组织为食，并在其组织中生长、繁殖，导致养殖动物大量死亡[2]。目前已有报道，海洋尾丝虫(Uronemamarinum)、水滴伪康纤虫(Pseudocohnilembuspersalinus)和贪食迈阿密虫(Miamiensisavidus)等能够引起大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[3-4]、鲈鱼(Dicentrarchuslabrax)[5]、比目鱼(Paralichthysolivaceus)[6]、海龙(Phyllopteryxtaeniolatus)[7]、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)[8]、蓝鳍金枪鱼(Thunnusmaccoyii)[9]等海洋鱼类发病[10]。近年来，有关海洋纤毛虫分离培养的研究仅限于不同培养液对其种群增长的影响，而对寄生性的纤毛虫在不同培养液中的毒理学实验数据报道较少。本研究从山东烟台地区患病大菱鲆的体表分离出贪食迈阿密虫，挑取单个虫体进行纯化培养，并筛选了4种盾纤毛虫常用的体外培养液，研究了不同培养基对其种群生长及复壮毒力的影响。 1 材料和方法 1.1 盾纤毛虫的分离与纯化培养 2018年10月，从山东省烟台市某大菱鲆养殖场收集被盾纤毛虫感染的大菱鲆(体长约15 cm)，刮取病鱼体表的溃烂组织，镜检发现有大量的盾纤类纤毛虫，经鉴定为贪食迈阿密虫(Miamiensisavidus)。在实验室进行虫体分离。步骤为：剪取鱼体部分病灶组织，剪碎，加入50 mL离心管中，置于18～20 ℃恒温培养箱内培养24～36 h。吸取纤毛虫培养液，滴入装有滤纸的漏斗进行过滤，反向滴洗滤纸，获得10 mL虫体收集液，经在显微镜下计数，其密度大于3×102个/mL。 1.2 4种培养液的制备 1.2.1 大肠杆菌培养液(DH) 取-80 ℃冻存的DH5α大肠杆菌100 μL作为细菌母液，于超净工作台中进行如下操作：在5个50 mL离心管中分别加入LB培养液，每管40 mL；用移液枪取25 μL细菌母液分至5个离心管中，将离心管放入37 ℃、200 r/min恒温摇床中摇菌24 h。然后将在恒温摇床中的LB液体培养基取出，放入离心机，以7 000 g离心10 min。于超净工作台中倾倒上清，加灭菌海水至10 mL，重悬大肠杆菌沉淀，再加海水至40 mL，放入离心机，以7 000 g离心10 min，反复冲洗2次。重悬大肠杆菌沉淀，再加海水至30 mL。于4 ℃冷藏备用。 1.2.2 牛肉浸膏培养液(BEV) 分别取牛肉浸膏10 g溶于100 mL人工海水中，配制成100 g/L牛肉浸膏培养液，静置24 h后备用。 1.2.3 米粒培养液(RV) 每100 mL灭菌人工海水中加入30粒消毒米粒，即配制成米粒培养液(RV)。 1.2.4 改良L-15培养液(盐度为10)(L-15) 配制640 mL的L-15(Leibovitz)培养液。分别添加腺苷(adenosine)、胞啶(cytidine)、尿苷(uridine)各90 mg，鸟苷(guanosine)150 mg，以及葡萄糖(glucose)5 g。添加250 mL脂质液(从干粉蛋黄中溶解1.6 mg/mL卵磷脂，以纯净水溶解0.8 mg/mL Tween 80，制备脂质液)。通过0.22 μm滤膜过滤。在无菌条件下，添加100 mL的10%胎牛血清FBS，添加前FBS应在56 ℃下水浴30 min灭活。最后添加10 mL 100×抗真菌剂(antibiotic antimycotic solution)。调节pH到7.2，再用0.22 μm滤膜过滤。 1.3 不同培养液对贪食迈阿密虫种群生长的影响 试验在12孔细胞培养板中进行，每孔加入2 mL培养液，参考张立坤等[11]的步骤进行接种：将处于种群生长平衡期的虫体分别接种至4种培养液中，在23 ℃