第十四章电泳分离技术.pptVIP

凝胶浓度及其分离范围 丙烯酰胺浓度 线性分离范围/kDa 15 12 10 7.5 5.0 10-43 12-60 20-80 36-94 57-212 当前第62页\共有97页\编于星期三\11点 SDS电泳装置 当前第63页\共有97页\编于星期三\11点 实验步骤 安装玻璃板 当前第64页\共有97页\编于星期三\11点 灌注分离胶 加水膜 约30min 后，胶凝聚后用水清洗几遍！并吸干残存的液体 当前第65页\共有97页\编于星期三\11点 灌注浓缩胶 灌满！ 当前第66页\共有97页\编于星期三\11点 根据需要插入不同的梳子 30min左右加电泳缓冲液，再拔梳子！ 当前第67页\共有97页\编于星期三\11点 拔梳子后形成点样孔 孔周围有膜，用针拨开 当前第68页\共有97页\编于星期三\11点 点样，电泳 当前第69页\共有97页\编于星期三\11点 - + 当前第70页\共有97页\编于星期三\11点 蛋白质电泳中SDS凝胶检测常采用的染色方法有: 考马斯亮蓝、硝酸银染色、荧光染色法。 当前第71页\共有97页\编于星期三\11点 染色液配制： 0.1% 考马斯亮蓝R250 (先用甲醇充分溶解) 50% 甲醇 10% 冰乙酸 40% 蒸馏水 滤纸过滤 脱色液配制： 10% 甲醇 10% 冰乙酸 80% 蒸馏水 5倍体积染色4小时以上， 脱色摇床，中间更换几次脱色液 当前第72页\共有97页\编于星期三\11点 硝酸银染色 银染的机制:来源于摄影银染技术,是将蛋白分子结合的银离子还原作成金属银。 优点:检测灵敏度高,较普通考马斯亮蓝染色灵敏度要高50-100倍,可在蛋白质中找到含量较低的蛋白,而且所需的上样量较少(每点仅需0.1ｎｇ)。 缺点:可重复性差 耗费人力 质谱测定有一定的干扰 当前第73页\共有97页\编于星期三\11点 当前第74页\共有97页\编于星期三\11点 在某一PH下，蛋白质分子在电场中不再移动，即静电荷为零，则此PH值即为该蛋白质的等电点。 4、等电聚焦 当前第75页\共有97页\编于星期三\11点 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectric Focusing，简称IEF)：利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。在电场作用下，蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。 当前第76页\共有97页\编于星期三\11点 PI2 PI3 PI1 + + - + + + - - + - - - PH增加 + _ 蛋白质 1 2 3 蛋白质在电场中，等点聚焦示意图 当前第77页\共有97页\编于星期三\11点 当前第78页\共有97页\编于星期三\11点 电泳系统中加进两性电解质载体，当通已直流电时，两性电解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。Pr进入时，不同的Pr移动到与其等电点相当的pH位置上，从而使不同等电点的Pr得以分离。 优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定Pr或多肽的等电点。 缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的Pr。 当前第79页\共有97页\编于星期三\11点 第二向根据蛋白质的分子量大小不同在垂直方向或水平方向进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS) 5、双向电泳 第一向根据蛋白质的等电点不同在PH梯度胶中等点聚焦（isoelectric focusing,IEF) 当前第80页\共有97页\编于星期三\11点 ■ 凝胶的聚合反应： Ammonium persulfate (free radical initiator)过硫酸铵 Acrylamide (monomer) Bis(acrylamide) (bridge) TEMED (catalyst):四乙基乙二胺 自由基的生成者 凝胶的基本單位:丙烯酰胺 交联使聚合产生分枝:甲叉丙烯酰胺 帮助传递自由基的催化剂 Acrylamide 有毒性！ - (O S-SO ) 4 4 2- 2 SO 4 CH2=CH-CO-NH2 1 2 1 1 2 核黄素-TEMED系统与过硫酸铵-TEMED系统 当前第30页\共有97页\编于星期三\11点 ■ 联丙烯酰胺单体聚合过程： 聚合反应