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苹果部分种质资源分子身份证的构建 0 总结 [研究意义]是世界上最大的苹果物种起源中心之一。 1 材料和方法 1.1 果造成的生长和测量 131份材料均取自国家果树种质兴城梨、苹果圃, 包括35份地方品种(1—35号)、77份育成品种(36 —112号)和19份近缘野生种(113—131号)(表1)。 1.2 ssr引物的合成 利用德国QIAGEN的DNeasy Plant Mini Kit提取嫩叶基因组DNA。在TP-M13自动荧光检测系统中, 用3条引物来进行PCR扩增。第1条引物是把普通的SSR引物的正向引物分别和M13的反向引物相连合成带有M13尾巴的引物,即TP-M13引物;第2条引物为正常的SSR反向引物;第3条引物是5′端带有荧光标记的M13正向引物。第1和第2条引物以普通SSR引物加M13接头生成即为TP-M13-SSR引物。选取已报道的长度在100—300 bp的普通SSR引物32对 PCR体系和扩增产物的纯化体系参照高源等 1.3 s12分析 Gene Mapper3.0软件分析ABI3730收集的数据,获得不同样品扩增片段的长度。Pop Gen32分析获得的供试材料指纹图谱数据,获得引物多态性,将每对引物获得的等位基因按照从大到小的顺序排列,并用阿拉伯数字从01开始赋值,将每份材料在3个位点获得的等位基因按照赋值数字编码获得每份供试材料独有的字符串。再利用条码技术将每份材料按相同位点顺序排列的编码字符串转化成每份材料独特的条码标识即分子身份证。 2 结果 2.1 引物的筛选条件对确定引物第一次pcr条件的影响,进行条件优化并筛选引物。条件道 由于TP-M13-SSR正向引物比反向引物多了19 bp的M13接头,使得引物退火温度较普通SSR引物更易出现扩增不稳定的情况。因此,必须对引物第一次PCR条件进行优化,并对引物进行筛选。从131份材料中随机选取两份材料,在45—60℃以0.5℃为梯度设定退火温度进行PCR扩增,用3%的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测。最终筛选出稳定性高、 重复性好的16对TP-M13-SSR引物(包含2对梨引物),优化退火温度(引物名称及序列见表2),用于131份苹果属植物指纹图谱构建。 2.2 ssr引物扩增多态性 16对TP-M13-SSR引物扩增131份苹果种质,共检测到326个等位基因,平均每对引物对品种扩增的等位基因数是20.3个。不同SSR引物扩增获得的等位基因数体现苹果种质不同位点SSR序列基本单元重复数的差异,而不同苹果种质扩增获得的SSR产物片段差异即体现苹果种质之间的差异。16对引物对131份苹果种质扩增的条带数及位点杂合度如表3,从表中可以看出,BGT23b对种质扩增的等位基因数最少为7个, 位点期望杂合度最低为0.122;CH05d04对种质扩增的等位基因数最多为49个,位点期望杂合度最高为0.878;其次是CH01f07a为48个。等位基因数超过平均数的引物还有CH03d07、CH04e03、CH04h02、 CH05b06和CH04g07。引物扩增可获得的等位基因数越多,期望杂合度越高,表明其更能反映不同品种的差异。利用Pop Gen32软件计算引物的多态性信息含量, 16对引物的平均多态性信息含量为0.7558,高于平均多态性信息含量的引物有CH03d07、CH04e03、 CH04h02、CH05c06、CH02a04、CH05d04、CH01f07a、 CH04g07和CH05h12。在等位基因数高于平均值的引物和多态性信息含量高于平均值的引物中,共有的为CH05d04、CH01f07a、CH03d07、CH04e03、CH04h02和CH04g07。16对SSR引物可区分供试苹果种质资源数量从11份到71份不等,平均每对SSR引物可区分49份苹果种质,区分率为8.09%—52.21%。其中对苹果种质区分率最高的是CH01f07a,最低的为BGT23b。只用1对SSR引物难以将全部供试苹果种质资源分开。但是,多态性信息含量和对苹果种质区分率高的引物将在本试验中构建苹果种质资源分子身份证价值最大。 2.3 最佳引物组合的筛选 根据每对引物对全部供试苹果种质区分率的鉴定结果,只用1对SSR引物难以将全部供试苹果种质资源分开。分子身份证的最终目的是对所有供试苹果种质均赋予可辨的分子身份证,而又要同时满足用最少的引物区分最多的苹果种质的要求,否则将会造成最终构建的分子身份证过余冗繁。因此,有必要通过逐步增加引物设定引物组合,筛选可以将全部供试苹果种质可以全部区分的引物。 将多态性信息含量和对苹果种质区分率高的引物即CH05d04、CH01f07a、CH03d07、CH04e03、CH04h02和CH04g07,两两组合,鉴定其对供试苹果种质的区分率。CH