基于srap的国兰种质资源遗传多样性分析及分子指纹图谱构建.docxVIP

基于srap的国兰种质资源遗传多样性分析及分子指纹图谱构建 0 型花地生兰中国南方地区 “研究意义”兰花是中国兰花，也被称为东路兰或东路兰，是兰科植物科的一种小型花卉植物。主要分布在中国南方，以及日本、韩国、泰国和其他地区。传统意义上的国兰主要包括春兰 ( Cymbidium goeringii ) 、 春剑 ( C. longibractium)、蕙兰(C. faberi)、建兰(C. ensifolium)、 寒兰(C. kanran)、墨兰(C. sinense)和莲瓣兰(C. lianpan)等7种 1 材料和方法 试验于2012—2013年在华侨大学花卉工程研究所进行。 1.1 材料和样品采集 本试验共收集139份国兰样本(表1),其中包含春兰品种31个,建兰品种14个,墨兰品种29个, 寒兰品种7个,春剑8个,莲瓣兰品种12个,蕙兰品种11个,杂交品种9个,野生兰18份。2012年9月 —2013年10月,材料分批采自华南植物园、远东国兰有限公司,福建南靖丰田兰园、云南大理点苍山、 云南曲靖大海草山等地。栽培品种采用随机采样,每份样本采集一个品种不少于20个成年株,对数量少于20株的品种进行全采;野生兰根据种群采样,不同种群主要根据地理分布、密度和年龄结构特点等进行界定,大的种群随机采集不少于20个成年个体作为一份样本,不足20个个体的种群进行全采样作为一份样本,共采集到18份。样本均经核实并鉴定,凭证标本保存于华侨大学植物生物技术实验室。 1.2 数据统计分析 1.2.1基因组DNA的提取与检测以国兰叶子为材料,采用改良的CTAB法 1.2.2 SRAP-PCR引物筛选及其检测参考Budak等 1.2.3数据统计分析对SRAP-PCR扩增产物电泳胶图进行人工读带,以DGL2000 Maker为分子量标准,对扩增条带按有(1)或无(0)进行统计,建立二元数据矩阵。计算多态性引物的总扩增条带数、多态性条带数和多态性条带比率。按照Botstein公式计算多态信息含量(polymorphism information content, PIC);用POPGENE32软件计算观测等位基因数(Na)、 有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样性指数(H)、 Shannon’s信息指数( I )。用NTSYS-pc2.10e软件UPGMA方法进行聚类分析构建聚类图,并计算遗传相似性系数(GS)。从17对引物组合扩增的图谱中筛选出多态性好、清晰、鉴别效率高的图谱,构建139份国兰种质资源数字指纹图谱,根据指纹图谱出现的概率公式P=1/2 2 结果 2.1 ssap扩增多态性分析 从208对引物中筛选出17对能扩增出较多特异性条带、且条带清晰的引物。图1为引物对Me12/Em8对139份供试样本的SRAP-PCR扩增图谱。17对引物对139份国兰种质进行SRAP扩增,共扩增出489条清晰条带,DNA片段长度在100—2 000 bp;不同引物的扩增带数从20—36条不等,引物M12-E8扩增的条带最多,为36条,引物M1-E5扩增的条带最少, 为20条,平均每对引物获得DNA谱带29条;在489条扩增带中,多态性条带484条,平均多态性条带百分率为98.89%,显示SRAP在国兰种质资源遗传多样性研究中具有高效性。 PIC值是衡量引物合适程度的重要指标,可以反映引物揭示信息量的多少,PIC值越高包含的信息量越大,当PIC0.5时,引物为高度多态性信息引物。在供试材料中,17对SRAP引物检测到的PIC值为0.9137—0.9566,均为多态性引物。可见所筛选出来的引物均为高度多态性信息引物,反映了供试国兰种质具有较高的基因多样性水平(表2)。 2.2 和时期野生兰种质组成 139份国兰种质资源的遗传相似系数变化范围为0.51—0.91。在相似系数为0.70时,所有供试样本可划分为6个类群(图2)。其中,Ⅰ类群包括全部供试春兰共31份样本,聚类结果基本与形态学划分春兰品种相一致,类群内种质相似程度较高,谱系清晰。Ⅱ类群包括42份样本,涵盖了几乎全部供试的建兰和墨兰品种,仅个别品种差异,且在相似系数0.70左右又可细分为IIa和IIb两个亚类;Ⅲ类群包含了墨兰品种‘金玉满堂’、供试的大部寒兰品种、蕙兰品种、杂交兰品种及18份野生兰全部共44份样本,在相似系数0.71处又可细分为Ⅲa和Ⅲb两个亚类;Ⅳ类群包括了供试春剑品种大部和莲瓣兰品种全部共19个样本,说明两种系资源亲缘关系较近。在相似系数0.76处可细分为Ⅳa和Ⅳb两个亚类;V类群仅包括细叶寒兰和大根寒兰2个品种。VI类仅‘彩虹’一个品种,并且较早从基部分离,与其他种系的关系难以判断,其真实的谱系还有待进一步确认。 2.3 国兰种质资源的鉴定 一般可以通过特异谱带和多个引物组合