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基于ssr标记的中国桃种质分子身份证构建 0 世界桃栽培面积和产量 [研究意义]中国是世界上重要的桃子生产国家。2008年世界桃总栽培面积和总产量分别为160万公顷和1 800万吨, 中国分别占48.7%和46.2% 1 材料和方法 1.1 近缘品种电子表 试材选自国家果树种质郑州葡萄、桃圃保存的237份桃种质, 包括140份地方品种、72份育成品种及其近缘野生种25份, 种质名称见电子表。 1.2 提取dna和pcr系统 采用CTAB法提取叶片基因组DNA。PCR反应体系为 (10μL) 0.6μL d NTP (2.5 mmol·L 1.3 数超过9条带 根据每对引物对不同品种扩增条带分子量的大小, 按从小到大依次编码为1—9, 如果总的带数超过9条带, 则参考已报道的该引物扩增带大小范围基础上, 并兼顾本试验中野生品种的谱带范围进行选择。当扩增带大小在限定范围内, 而扩增条带编码超过9条时, 将该类带型赋值为0。当引物对某一品种扩增有2个等位基因时, 按等位基因碱基数较小的条带编码进行赋值。 2 结果 2.1 ssr引物的确定 为了使构建的分子身份证的编码体现不同染色体的信息, 尽量选择均匀分布在桃8条染色体上的SSR引物, 用80对SSR引物对随机挑选的40个品种进行扩增, 最终确定16对多态性较高的引物用于分子身份证的构建, 这些引物在染色体上的位置参见图1。 2.2 ssr扩增多态性 16对SSR引物对237份桃种质进行扩增, 共检测到203个等位基因, 平均每对引物对品种扩增的等位基因数是12.7个。其中, UDP98-409对不同品种扩增结果见图2, 显示9个品种共有4个等位基因。 由于每个SSR序列的基本单元重复次数在不同基因型间差异很大, 从而形成其座位的多态性即等位基因的数目不同。16对引物对237份种质扩增的条带数及其多样性指数如表1, 从表中可以看出, BPPCT023对品种扩增的等位基因数最少, 为5个;BPPCT008最多, 为22个。等位基因数超过平均数的引物有BPPCT020、UDP96-013、UDP96-008、BPPCT017、BPPCT008和CPPCT022, 等位基因数越多, 表明更能反映不同品种的差异。利用Genetics Statistics 3.0 2.3 扩增的谱带范围 16对引物对不同种质扩增的等位基因谱带大小分布范围如表2, 相同引物在本试验和其它文献中报道的结果有差异。其中, BPPCT028在本试验中扩增谱带大小高于其它文献中的报道结果, BPPCT034、BPPCT007、BPPCT023、BPPCT014、BPPCT008和UDP98-409在本试验中的扩增谱带范围与其它文献报道结果基本相似;BPPCT020、CPPCT005、BPPCT017、UDP98-407、CPPCT022和UDP98-405在本试验中扩增的谱带范围比其它报道的宽;UDP96-013、UDP96-008和CPPCT006在其它文献中报道只扩增出1条带, 而在本试验则分别扩增出17、15和8条带。可见16对引物对本试验所用材料扩增的等位基因数和谱带范围基本上均高于前人报道, 这与试验所用材料的遗传背景更为丰富有关。 由于在本试验中, 为了保证分子身份证字符串的每位上只有1个字符, 因此, 在赋值时只赋1—9, 对于等位基因数超过9的引物, 采用只考虑其中9条带的方法来进行。同时, 在本试验中由于多数种质为地方品种和育成品种, 因此, 主要选择对这些品种区分能力较高的等位基因, 也兼顾野生种特有的等位基因 根据等位基因选择与赋值标准, 以‘上海水蜜’为例, 其在16个引物下的扩增条带只选择位点较小的进行编码, 即保证每引物下的编码只有一位数字 (图3) 。 2.4 分子身份证编码 根据各引物对品种的扩增结果和表3中等位基因的赋值标准, 对237份种质赋值, 结果显示, 其中的202份具有特异的分子身份证编码 (表4) 。 在202份具有特异分子身份证的种质中, 有15份种质具有至少1个特异的等位基因位点, 因此, 仅用1对引物就能与其它种质区分 (表5) 。其中, 辽梅、美人梅1和毛樱桃1有2个特异的等位基因。 此外, 237份种质中有35份种质不具有特异的分子身份证, 即其分子身份证编码在不同品种间出现相同的情况 (表6) 。 2.5 人格多样性分析 16个引物组合能对237份种质中的202份形成可辨的分子身份证编码, 即85.2%的种质得到区分, 平均每对引物能区分12.7份种质。由于桃种质共有上千余份, 而分子身份证的最终目的是对所有种质均赋予可辨的分子身份证, 在本试验中初步构建的种质分子身份证已经有16位, 如果继续对更多的品种构建分子身份证, 势必增加筛选的SSR引物数量, 结