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基于酸性蛋白酶的啤酒发酵产质研究 天冬氨酸酶是一种具有丰富化学和物理性质的天冬氨酸酶。它的活性物质中心含有一些羧基，可以有效地分解为酸性介质（ph-4.5）。 啤酒、白酒和酱油等的酿造常用酸性蛋白酶作为蛋白澄清剂。在啤酒发酵糖化阶段，利用酸性蛋白酶可降解底物麦芽中的蛋白质，通过添加适量的酸性蛋白酶阻止啤酒遇冷浑浊的现象 本研究以宇佐美曲霉（ 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 倍体的分离和鉴定 本研究所用的宿主菌为酿酒酵母单倍体BY4741，武汉淼灵生物科技有限公司（his3Δ1，实验室改造后为SD-Ura缺陷性酵母）和酿酒酵母二倍体82-9-35（实验室前期分离得到，his3Δ1，为SD-Ura缺陷性酵母）。生物工程公司合成含宇佐美曲霉的酸性蛋白酶基因 1.1.2 培养基的制备 0.4 mol/L碳酸钠溶液、乳酸缓冲液（pH 3.0）、0.4 mol/L三氯乙酸、0.5 mol/L氢氧化钠、10.00 mg/mL酪素溶液、100 μg/mL酪氨酸标准溶液、1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)、0.5 mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH 8.0）、TE缓冲液、氨卡青霉素(Amp)、1 mol/L山梨醇、酵母感受态制备处理液、酵母全营养培养基（YPD）、尿嘧啶缺陷型合成葡萄糖基础培养基（SD-URA）、Luria-Bertain（LB）培养基和LB-Amp培养基的配制方法参照Zhang等 1.1.3 引用 1.1.4 仪器、试剂和仪器 FB-K20恒温金属浴，上海枫岭生物技术有限公司；MJPS-250生化培养，上海精宏实验设备有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；KQ-300DE超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；PB-10 pH计，北京赛多利斯仪器系统有限公司；LDZX-50KBS灭菌锅，上海申安医疗器械厂；DYY-10C电泳仪，北京市六一仪器厂；BG-sub M2DI水平电泳槽，百晶生物技术有限公司；FRESCO17低温高速离心，Thermo；C1000 PCR仪，Biorad公司；GBOX-EF凝胶成像系统，Syngene公司；ND-1000微量紫外分光光度计，Nanodrop公司；DYY-6C电穿孔仪，北京六一生物科技有限公司；AUW-220D十万分之一天平，岛津公司。 1.2 方法 1.2.1 dna聚合酶系统合成 基因通过NCBI查找相应序列并进行优化，由生工生物工程公司合成，利用宝生物的DNA聚合酶扩增体系扩增 1.2.2 杆连接 一步克隆连接的表达载体转化入 1.2.3 为目标酶基因注入官邸官邸 OMEGA质粒提取试剂盒提取大肠杆菌中含有 1.2.4 u.dk/htu.dk/h.dk/h 在网址 http://www.cbs.dtu.dk/services/Signal P/进行 1.2.5 酸性酶活性测定 酶活力单位的定义和酶活的测定方法和计算公式参照 2 结果与分析 2.1 谷物体积构建 根据NCBI网站中宇佐美曲霉的酸性蛋白酶基因( 2.2 高度转化的饮酒培养基 参考 2.3 酸性蛋白酶活性变化 由图6可知，在培养温度30 ℃条件下，酿酒酵母表面展示的酸性蛋白酶96 h内的酶活曲线图。在72 h左右出现最高酶活，72 h前随着酵母培养时间增加，酶活呈现上升的趋势，而在72 h后酸性蛋白酶活性随时间呈下降的趋势，并且82-9-35-8的酶活96 h内基本高于BY4741-i。推测其酶活下降的原因可能是酵母培养基中的营养物质被酵母消耗减少，酵母自身生长能力下降所致。其在72 h前酶活上升的原因与酵母在72 h内繁殖增长相关。 2.4 监测阳性酵母的生长曲线 重组酵母和宿主菌（BY4741和82-9-35）分别在SD-ura和PD上划线培养，48 h后挑取单菌落接种到50 mL的SD-URA选择性液体培养基和YPD液体培养基中，30 ℃、200 r/min培养48 h进行活化后，用血球计数板进行活菌计数，以1×10 用YPD液体培养基培养重组酵母和原菌株，每隔6 h取样600 nm处测定吸光度，绘制重组酵母与对照菌株的生长曲线，如图7所示。0~24 h，所有菌株处于生长延滞期。24 h后所有菌株迅速繁殖，30~54 h是所有酵母的生长对数期，在对数前期，二倍体菌株的生长速度比单倍体快；在对数后期，单倍体的生长速度超过二倍体，最终单倍体的生长量高于二倍体。表面展示 如图8所示，当阳性转化子BY4741-i和82-9-35-8在YPD培养基上的生长进入平衡期前，细胞数量积累很多，酶活剧烈上升，并在细胞生长平衡期时酶活基本达到最大值。72 h左右酶活达到最大值，之后酶活呈下降的趋势。推测由于培养基营养物有限，细胞相互间竞争，死亡的细胞数和新生的细胞数持平，因