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柚皮多糖的安全性评价 1 沙田柚的功能 桃子也是柑橘。这是云香家族中最重要的水果之一。由于其独特的营养价值，消费者非常喜欢它。广东是柚子生产大省,柚子在广州市和梅州市均属于农业战略龙头产品。柚子的栽培历史悠久,沙田柚在梅州市的总种植面积为40万亩,产量在30万吨以上,是目前全国最大的金柚商品生产基地。1995年,梅州被国家首批百家中国特产之乡组委会命名为“金柚之乡”。李时珍的《本草纲目》中指出,柚子具有很多功效,能治疗消化不良,对酒精中毒有很好的去毒效果,还可以清除肠道中的杂气,而且对毛发具有较好的滋润顺滑作用 柚子皮占整个柚子重量的43%到48%,其含有丰富的多酚、异黄酮、多糖和类柠檬苦素等活性物质。柚子的外皮含有香精油和天然色素,白色囊衣富含膳食纤维等,这些成分的含量均高于柚子果实 2 材料和方法 2.1 实验材料与小鼠 实验用沙田柚采自梅州市梅县区沙田柚生产基地,选择品种和大小相同、果色均匀、成熟度基本一致、无机械损伤且无病虫侵染的柚果作为实验材料。将果皮切成薄片(2cm×2cm)后在恒温干燥箱(50℃)中烘干,粉碎成粉末备用。 二级昆明小鼠:6～7周龄,体重18～22 g;雄性大鼠:体重180～220 g,购自军事医学科学院动物中心。 2.2 实验仪器与菌株 仪器:双人单面超净工作台;DU-730型紫外可见分光光度计(日本岛津分析仪器厂);HH-2恒温水浴锅(北京盈讯智源科技有限公司);ZF-60电热恒温培养箱(上海能共实业有限公司);RE-52 AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);Biofiuge Stratos台式高速冷冻离心机(克勒格瓦尼(上海)分析仪器有限公司);QYC-200 C空气恒温摇床(广州沪瑞明仪器有限公司);BILON-J3菌落计数器(上海华光仪器仪表有限公司);凝胶渗透色谱仪(填料为SephadexG-200,美国Waters公司)。 试剂:0.5 mmol/L组氨酸-0.5 mmol/L生物素溶液,Vogel-Bonner(V-B)培养基E,葡萄糖溶液(质量浓度为20%),甲醇、环磷酰胺、阳性诱变剂(4-硝基喹啉-N-氧化物),均购于广州蕊特生物科技有限公司。 实验菌株采用TA98和TA100菌株(江苏省疾病控制中心提供),于80℃保存。实验菌株于37℃水浴振荡培养24 h,4℃保存。姬姆萨染色液购于青岛海博生物技术有限公司。 2.3 实验方法 2.3.1 滤渣的制备 称取100 g (以干基计)柚子皮粉末,加入2500 mL蒸馏水,50℃浸提2.5 h后,将浸提液进行抽滤,得到的滤渣重复上述步骤2次,合并滤液,于50℃真空浓缩至500mL,备用。 2.3.2 取剂的橙色果皮 参照史军花等 2.3.3 前小鼠的饲养及处理 采用最大耐受剂量法进行实验。实验用小鼠为二级昆明小鼠(6～7周龄,体重20 g左右),包含雄性和雌性(每组10只)。经5 d检疫后,饲养于恒温、恒湿环境,将小鼠称重后随机分笼,每笼5只。 按照给药(实验组)和未给药(空白组)处理小鼠,处理前小鼠空腹16 h。实验组小鼠灌胃最大给药剂量的柚子皮提取物(0.9 mL),药物浓度为35.45 g/kg,灌胃后连续观察2周,记录小鼠的中毒症状及死亡情况。测试指标包括实验前后小鼠体重的平均值和解剖后的肝脏重量 2.3.4 增强受试物的耐药性 由于鼠伤寒沙门氏菌TA98及TA100具有组氨酸合成缺失突变特征,故可增强受试物渗透进入细胞的能力。TA98和TA100具有细胞壁脂多糖缺失突变和抗性R因子,这会使细菌产生对抗生素的耐药性并增加检测的敏感性。鉴定方法采用鼠伤寒沙门氏菌回复突变实验标准判断法 (2) 多氯联苯玉米油的注射 大鼠S9是肝脏或小肠组织匀浆液的去线粒体上清液,含有丰富的药物Ⅰ相代谢酶和Ⅱ相代谢酶,被广泛用于评价药物的体外代谢特征和毒理研究(Ames试验)。实验用大鼠腹腔注射多氯联苯玉米油溶液(200 mg/mL),注射剂量为500 mg/kg。5 d后将大鼠处死,取其肝脏称重。用0.15mol/L的KCl溶液洗涤剪碎后的肝组织4～5次,按照肝重:溶液=1:3的比例(g:V)向肝组织中加入0.15 mol/L的KCl溶液制成匀浆液,9000 g离心10 min,取其上清液(S9)分装于塑料管(2 mL/管),液氮冷冻保存。 (3) 空气振荡培养模式 在肉汤培养液中接入鼠伤寒沙门氏菌,培养温度为37℃,采用空气振荡(100～120r/min),连续培养约10h。回复突变实验采用平皿掺入试验预保温法 (4) 基因反应法回复突变菌落计数溶剂 通过显微镜观察细菌的背景菌苔,空白(溶剂)对照组和对照组如无明显稀疏,则进行回变菌落计数。如对照组在1个或1个以上测试浓度时,诱发的回复突变菌落数比空白(溶剂)对照组增加1倍以上,且具有剂量依