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高效液相色谱法检测caco-2细胞 cac-2细胞来自人类的结肠癌细胞。在传统的细胞培养条件下，它们可以自发地分裂并形成肠道细胞样本。与人小肠上皮细胞在形态上非常相似，具有相同的细胞极性和紧密连接，因此，可以作为研究药物的肠道渗透性模型 1 实验部分 1.1 药物、试剂和仪器 Countess II细胞计数器(美国Invitrogen);MERS00002 Millicell ERS-2细胞电阻仪(美国Millipore);20A高效液相色谱仪(日本岛津)。酒石酸美托洛尔、阿替洛尔(中国食品药品检定研究院，批号分别为:100084-201403、100117-201606);甲硝唑(广西金兴实业有限公司);Hank’s平衡盐溶液(北京索莱宝科技有限公司);DMEM培养基(美国Gibco);FBS(上海中乔新舟生物科技有限公司);青霉素-链霉素双抗液、胰蛋白酶(美国HyClone);MTT(北京百灵威科技有限公司);PBS缓冲液(北京中杉金桥生物有限公司)。Caco-2细胞株(美国模式菌种收集中心，批号:HTB-37，传代数为30～40代)。 1.2 方法和结果 1.2.1 caco-2细胞模型的构建和评价 将Caco-2细胞培养于细胞瓶中，并置5%CO 1.2.2 安全范围的确定 采用MTT法，将Caco-2细胞以每孔5×10 1.2.3 样品的预处理和色度条件 在转运实验过程中得到的间隔取样细胞样品及单次取样细胞样品，均经过台式高速冷冻离心机，以1×10 1.2.4 白砂糖液对药物检测的干扰 取混合对照品、酒石酸美托洛尔对照品、阿替洛尔对照品、甲硝唑及空白细胞等溶液，分别进样10μL。空白细胞液对酒石酸美托洛尔、阿替洛尔、甲硝唑药物的检测均无干扰，且3种药物之间无相互干扰。称取适量酒石酸美托洛尔、阿替洛尔、甲硝唑，配制9个不同浓度的对照品溶液，酒石酸美托洛尔、阿替洛尔、甲硝唑的浓度范围分别为0.82～135.72、0.43～65.41、0.88～133.87μg·m L 1.2.5 进样及测峰面积测定 取任一对照品溶液，进样10μL，连续进样6次，测定峰面积。计算得酒石酸美托洛尔、阿替洛尔、甲硝唑峰面积的RSD分别为0.8%、0.4%、0.5%。 1.2.6 阿替菲尔回收率试验 精密称取适量酒石酸美托洛尔、阿替洛尔、甲硝唑，分别配制成相当于酒石酸美托洛尔、甲硝唑转运给药浓度的80%、100%、120%,50%阿替洛尔转运浓度的80%、100%、120%，每个浓度配制3份，分别进样10μL，计算3种药物的回收率及RSD。酒石酸美托洛尔、阿替洛尔、甲硝唑的回收率分别为98.36%、99.15%、99.23%,RSD分别为1.13%、0.87%、1.01%，回收率均为98%～102%,RSD均2%，说明该方法的准确度较好。 1.2.7 测定峰面积的测定 取同一供试品溶液，在37℃下放置，分别在样品制备后的第0、0.5、1、2、4、6小时进样，测定峰面积。取同一供试品溶液，置室温条件下，分别在样品制备后的第0、1、2、4、6、8、12、24、48小时进样，测定峰面积。计算得3种药物在37℃条件下和室温条件下的RSD均2%，表明含3种药物溶液在37℃条件下6 h内稳定性良好，在室温条件下48 h内稳定性良好。 1.2.8 平衡盐溶液 将培养至21 d的Transwell 12孔板用PBS缓冲液清洗，洗涤2～3次，并在AP侧加入0.5 m L Hank’s平衡盐溶液，BL侧加入1.5 m L Hank’s平衡盐溶液平衡15min。之后将两侧Hank’s平衡盐溶液吸出，并在AP侧加入0.5 m L给药溶液(酒石酸美托洛尔、阿替洛尔、甲硝唑均为100μg·m L 2 dmso与mtt的反应 文中用MTT比色法检测细胞毒性，通过活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶将MTT还原成蓝紫色结晶甲瓒，用DMSO溶解甲瓒，测定OD值。其OD值越大，说明生成的甲瓒越多，药物产生的细胞毒性越小