DB37_T 3086-2017猪附红细胞体PCR检测技术.pdf

ICS65. 020. 30B41DB37山東东省地方标准DB37/T3086—2017猪附红细胞体PCR检测技术PCR Assay for Detection of Swine Eperythrozoon2017-12-29发布2018-01-29实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T 3086—2017前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：陈蕾、杜以军、齐静、丛晓燕、孙文博、陈智、郭立辉、于江、吴家强、李俊、时建立，I DB37/T 3086—2017猪附红细胞体PCR检测技术1范围本标准规定了猪附红细胞体PCR检测技术的操作要求本标准适用于猪附红细胞体的实验室诊断、监测和流行病学调查等。2实验室生物安全要求实验室必领为生物安全IⅡI级（BSL-2级）及以上实验室。3规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和实验方法t4术语与定义下列术语与定义适用于本标准。4. 1PCR聚合酶链式反应。4. 2SDS十二烷基硫酸钠。5仪器设备和试剂5.1仪器设备5. 1. 1微量移液器（最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL），带滤芯的枪头。5. 1. 220000r/min低温高速离心机。5. 1. 3电热恒温水槽。5. 1. 4稳流稳压电泳仪。5. 1. 5水平电泳槽。5. 1. 6凝胶成像系统。5. 1. 7紫外透射反射分析仪。5.1. 8电磁炉。5. 1. 9烧杯（1000ml）， DB37/T 3086—20175.1.10电子天平精度为：0.001g。5.1.11PCR扩增仪。5.1. 12-20C冰柜.5.1.132℃~8C冰箱5.2试剂除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯。5. 2. 1蛋白酶K（见附录A.1）。5. 2. 210%SDS液（见附录A.2）5. 2. 370%乙醇（见附录A.3），5. 2. 41.0%琼脂糖凝胶（见附录A.4）。5. 2. 5DNA Marker DL2000.5. 2. 6超纯水：符合GB/T6682，三级。5. 2. 7引物：MSFwd:5CGAGCGCAACCCTTCATAT3MSRev:5CTACCATTGTAGCACGTTTGCA3:扩增片段大小127bp6操作程序6. 1样品的采集和处理6. 1. 1样品的采集临床上猪的血液（肝素抗凝血），置于2℃～8℃冰箱保存。6. 1. 2样品的处理6.1.2.1取肝素抗凝血液约5ml。6. 1. 2. 2阳性对照处理：猪附红细胞体DNA6. 1. 2. 3阴性对照处理：灭菌双蒸水。6. 2DNA的提取用蛋白酶K裂解法提取总DNA。6, 2. 1取肝素抗凝血500μL于1.5mL离心管中，加入50μg/mL的蛋白酶K55L，加入10%的SDS 溶液25μL,55℃C水浴2 h~3 h。6. 2. 2加入200μLTris饱和酚，充分混匀，10000g离心15min。6. 2. 3取上清于—新的离心管中，加入200μLTris饱和酚和200μL氯仿，10000g离心15min。6. 2. 4取上清于一新离心管中，加入200μL氯仿，10000g离心15min。6. 2. 5取上清于一新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置20min，10000g离心15min，弃上清。6. 2. 65加入70%的乙醇冲洗沉淀表而及管壁，弃乙醇，晾干。6. 2. 7加入100μL灭菌双蒸水溶解沉淀，-20C保存备用。试验中同时设立猪附红细胞体DNA作为阳性对照和灭菌双蒸水作为阴性对照。6.3PCR2 DB37/T 3086—2017PCR为50μL体系，按表1中17的循序配制。表1PCR反应体系（50μL)序号体系组成体系含量1灭菌双蒸水37. 5 μL2DNA4 μL310 mmo1/L上游引物0. 5 μ L10 mmol/L下游引物0. 5 μ L510 X PCR Buffer5 μ L2. 5 mo1/L dNTPs2 μ LTaq醇0. 5 μ L首先加入双蒸灭菌水，然后按顺序逐一加入上述成分，每次要加入到液面下。全部加完后，混悬，瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。循环参数为95℃5min，94℃30s，52℃445 s, 72 C 1min,循环30次，72℃延伸10min结束。6. 4电泳6. 4. 1制备1.0%琼脂糖凝胶板，！见附录A.4。6. 4. 2取5μLPCR产物与0.5