DB34T 2167-2014油菜黑胫病菌鉴定方法.docxVIP

ICS 65.020 B 30 安 徽 省 地 DB34 方 标 准 DB 34/T 2167—2014 油菜黑胫病菌鉴定方法 Detection and identification of Leptosphaeria biglobosa (Desm.) Ces. et De Not. 文稿版次选择 2014 - 09 - 23 发布 2014 - 10 - 23 实施 安徽 省 质 量 技 术 监 督 局 发 布 I DB34/T 2167—2014 前 言 本标准依据 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省农业科学院作物研究所提出并起草。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草人：荣松柏、李强生、胡宝成、江莹芬、陈凤祥、吴新杰、费维新、侯树敏、范志 雄、雷伟侠、郝仲萍。 1 DB34/T 2167—2014 油菜黑胫病菌鉴定方法 1 范围 本标准规定了油菜黑胫病菌的现场和室内鉴定的依据和检测方法。 本标准适用于油菜黑胫病菌的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 鉴定依据 油菜黑胫病菌 Leptosphaeriabiglobosa (Desm) Ces. de Not.属真菌界(Fungi)，子囊菌门 (Ascomycota) ， 座 囊 菌 纲 (Dothideomycetes) ， 格 孢 腔 菌 目 (Pleosporales) ， 格 孢 腔 菌 科 (Pleosporaceae)，小球腔菌属(Leptosphaeria)；无性态属茎点霉属Phomalingam。 由Leptosphaeria biglobosa 病菌引起的油菜病害称为油菜黑胫病。 鉴定依据： 以油菜黑胫病为害症状、病菌形态学特征、PCR 反应和致病性测试结果为鉴定依据。 4 主要仪器与用具 生物显微镜、体视显微镜、培养箱、植物生长箱、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、高压灭 菌锅、液氮罐、制冰机、PCR 仪、凝胶成像系统、电泳仪、冰箱、旋涡振荡器、电子天平(感量 0.01 g) 、 烘箱、培养皿、酒精灯、解剖刀、接种针、移液器、离心管。 5 主要试剂与材料 5.1 试剂 次氯酸钠， 链霉素，氨苄青霉素， 商用DNA提取试剂盒或 DNA 提取试剂： Tris base， EDTA，NaCl， SDS， β-巯基乙醇，聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)， 林菲罗琳；PCR 试剂：PCR buffer，Mgcl2 ，dNTP， Taq 酶；凝胶电泳试剂： 琼脂糖，TAE，Loading Buffer，EB。 5.2 培养基 琼脂培养基(Agar)，马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA- potato dextrose Agar)，马铃薯葡萄糖 肉汤(PDB-potato dextrose broth)液体培养基，V8 果汁琼脂培养基。见附录A。 5.3 对照菌株 2 DB34/T 2167—2014 油菜黑胫病菌(Leptosphaeriabiglobosa (Desm) Ces. de Not.) 菌株；油菜茎基溃疡病菌 (Leptosphaeriamaculans (Desm) Ces. de Not.) 提取的DNA(L. maculans 不是必需的)。 6 现场检测 植株症状诊断——在油菜生长期进行田间症状目测踏查。 根据油菜黑胫病典型症状进行诊断。 ——子叶/叶片症状：黑色坏死斑点(由致病力弱的菌株造成)；或灰白色病斑(由致病力强的菌 株造成)， 病斑易破裂，有黑色小粒点(为分生孢子器)。(见附录 B， 图 1、2、3) ——茎杆表面症状： 早期染病茎秆部位呈灰色， 病斑处有黑色的边界。后期茎秆干枯时， 病斑呈灰 白色，有时灰白色病斑处有小黑点(分生孢子器)生成。(见附录 B，图 4、5) ——茎秆横截面症状：感染组织横切面有黑色部分，为茎髓组织溃疡，面积因病菌侵染程度而不同， 严重时染病植株茎基部受侵染形成腐烂。(见附录 B，图 6、7) 对于田间不能确定的，采集疑似症状的植株样本进行室内检测鉴定。 7 实验室检测 7.1 病菌的分离纯化 见附录C。 7.2 菌落培养特性和病菌形态特征鉴定 病原菌(L. biglobosa) 在PDA 平板上， 菌丝呈黄色绒毛状，菌丝分枝少，菌落规则。 培养一段时间后，气生菌丝上产生黄色(或黄棕色、红棕色)液珠，且菌株间存在色素水平差异。 在衰老菌丝体上可观察到黑色小粒点(为分生孢子器)，(见附录D，图1