SNT 1771-2006进出口粮谷中T-2毒素的测定 免疫亲合柱—液相色谱法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1771—2006进出口粮谷中T-2 毒素的测定免疫亲和柱-液相色谱法Determination of T-2 toxin in cereals for import and export-Immunoaffinity column and liquid chromatography method2006-04-25发布2006-11-15 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局家尿线10515“数码防伤 SN/T 1771—2006前言本标准的附录 A为资料性附录本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人：卫锋、李军、隋凯、方晓明。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1771--2006进出口粮谷中T-2 毒素的测定免疫亲和柱-液相色谱法1范围本标准规定了进出口粮谷中 T-2毒素检验的制样和免疫亲和柱-液相色谱测定方法。本标准适用于进出口玉米、小麦中 T-2 毒素的检验。2制样2.1试样制备将样品按四分法缩分至1kg，全部磨碎并通过20目筛，混匀，均分成两份作为试样，分别装入洁净的容器内，密封,标明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。2.2试样保存将试样于5℃以下避光保存。3测定方法3.1方法提要试样中的T-2毒素用甲醇-水提取后，提取液经免疫亲和柱净化，浓缩、衍生、定容后，用配有荧光检测器的液相色谱仪进行测定，外标法定量。3.2试剂与材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。3.2.1 甲醇。3.2.2 乙腈:HPLC级。3.2.3甲苯:HPLC级。3.2.4甲醇+水(8+2):取80 mL甲醇加20 mL水。25mg/mL 4-二甲基氨基吡啶(DMAP)溶液：准确称取0.0325g于100mL容量瓶，甲苯稀释至刻度。 mg/mL 1-氰酸葱(1-Anthroylnitrile,1-AN)溶液：准确称取 0.030 0 g 于100 mL容量瓶，甲苯稀释至刻度。3.2.7 T-2毒素标准品：纯度≥98%。3.2.8T-2毒素标准溶液：准确称取适量的 T-2毒素标准品，用乙配成浓度为0.5mg/mL的标准储备液。按所需要的浓度进行稀释，作为标准工作溶液使用。3.3仪器与设备3.3.1.液相色谱仪配有荧光检测器。3.3.2粉碎机。3.3.3高速均质器。3.3.4氮吹仪。3.3.5空气压力泵。3.3.63玻璃纤维滤纸。 SN/T 1771—20063.3.7免疫亲和柱：T-2毒素免疫亲和柱。3.3.8移液器。3.4测定步骤3.4.1提取称取试样50g(精确到0.1g)于500mL玻璃混合杯中，加人100mL甲醇+水(8十2)，均质器高速均质2min，3000r/min离心5min，取上清液用定量滤纸过滤，移取10.0mL滤液并加人40.0ml水稀释混勾，以玻璃纤维滤纸过滤，收集滤液3.4.2净化将免疫亲和柱连接于;10mL玻璃注射器下。准确移取10.0mL(相当于1.0g样品)上述提取滤液注人玻璃注射器中,将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以药1mL/min 流速缓慢通过免疫亲和柱，直至 2 mL～3 mL空气通过柱体。以10 mL水淋洗柱子1次,莽去全部流出液，并使2 mL～3mL空气通过柱体。加入1.5mLHPLC级甲醇洗脱,流速为1mL/min，收集洗脱液于玻璃试管中，在50℃以下氮气吹干，待衍生。3.4.3衍生于上述净化后的样品中，分别加人5oμL浓度为0.325mg/mL4-二甲基氨基吡啶(DMAP)溶液和50μL浓度为0.3mg/mL1-氰酸愈(1-AN)，涡旋混合 1min，于 50℃士2℃恒温水浴中反应15 min，在冰水中冷却10 min。在 5g℃以下氮气吹于：用1.0 mL的流动相溶解,待测。注：对于 T-2毒素含量较高的样品，可将提取滤液进行适当稀释;以保证T-2霉素的含量不超过免疫亲和柱的吸附容量。3.4.4测定1色谱条件色谱柱:ZORBAX Eclipse XDB-Cr:柱,4.6X150 mm,5 μm,或相当者;a)流动相：乙腈+水（80+20）；b）流速:1.0 mL/min;c）d）检测波长：激发波长381nm;发射波长476nm;e）,进样量:20 μL。液相色谱测定根据样液中T-2毒素衍生物含量情况，选定浓度相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中T-2毒素衍生物响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样进行测定。标准品色谱图参见附录 A中图 A.1。3.4.5空自试验除不加试样外，均按让述步骤进行。3.4.6结果计算和表述用色