SN_T 3403-2012菜豆疫霉检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3403—2012菜豆疫霉检疫鉴定方法Detection and identification of Phytophthora phaseoli Thaxter2012-12-12 发布2013-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3403-2012前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检验局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：程颖慧、王颖、高文娜、章桂明、汪莹。I SN/T 3403—2012菜豆疫霉检疫鉴定方法范围1本标准规定了利马豆(Phaseolus lunatus L.）上的菜豆疫霉病菌(Ph ytophthora phaseoli Thaxter)的检疫和鉴定方法。本标准适用于对菜豆疫霉寄主的种子和植株的检疫。 规范性引用文件2下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T 1809进出境植物种子检疫规程SN/T 2122进出境植物及植物产磊检疫抽样3原理3.1分类学地位英文名:Lima Bean Downy Mildew学名:Phytophthora phaseoli Thaxte菜豆疫霉病菌属真核生物（Epkaryota）、藻菌界（Chromalvcolata）、卵菌纲（Oomycetes）、腐霉目(Pythiales）、腐霉科（Pythiaceae）度霉属（Phytobhthora);3.2病原菌传播方式以卵孢子或病残体在土壤里趣冬，种子或痘荚中形的卵孢子越冬后可作为初侵染源。在湿度大的条件下，病菌产生大量孢子囊，孢子囊借助风雨传播！3.3鉴定原理根据病原菌的分布、寄主范围以及在寄主植物上的为害症状（参见附录 A）、形态特征等，应用显微镜等相关仪器对菜豆疫霉进行检疫鉴定。4仪器用具和试剂4.11仪器用具体视显微镜、显微镜、烘箱、灭菌锅、超净工作台、光照培养箱或光照培养架、紫外灯管、手持放大镜、滤纸、烧杯、培养Ⅲ、试管、三角瓶、镊子、手术刀、载玻片、盖玻片、量筒、酒精灯、吸管。4.2试剂及培养基4.2.1 试剂无菌水、1.25%次氯酸钠。 SN/T 340320124.2.2培养基利马豆培养基：利马豆200g加人800ml蒸馏水煮沸1h后去除残渣，加18g琼脂，充分溶解后定容为1 000 mL,混匀后分装于三角瓶中，121℃高压灭菌20 min。5现场抽样按照SN/T1809及 SN/T 2122规定进行取样。6 实验室检疫6. 1 症状检查肉眼或体式显微镜下检查利马豆样品表面病原菌及病斑情况。6.2保湿培养6.2.1种子保湿培养将检验样品用有效成分为1.25%的次氯酸钠溶液表面消毒3min～4min后，灭菌水洗涤3次，放在垫有3层已灭菌湿滤纸的直径90mm培养Ⅲ中，每皿20粒，在20℃条件下放置24h后，转人-20℃冷冻24h，转至20℃培养箱或培养架上培养，黑暗和紫外12h交替培养，从培养第3天后开始观察种子上是否出现白色菌丝或霉状物。6.2.2新鲜植物组织保湿培养取寄主植物组织，冲洗掉表面的泥土杂物，有效成分为1.25%的次氯酸钠溶液中表面消毒3min~～4min后，灭菌水冲洗3次，放在垫有3层灭菌湿滤纸的培养皿中，转至20℃培养箱或培养架上培养，黑暗和紫外光照12h交替培养，观察植物组织表面是否出现白色菌丝或霉状物。6.3病原菌纯化挑取保湿培养后的疑似菌丝置于利马豆培养基上，20℃黑暗条件下培养。培养3周后，长成直径18 mm～21 mm 的放射状菌落。制片，进行形态学检测。6.4形态学特征观察在显微镜下观察病原菌形态学特征。7鉴定特征受侵染的利马豆豆荚在湿度大的条件下长满白色棉絮状菌丝，同时产生大量的孢子囊，病健交接处有明显的淡红色的边缘，受侵的豆荚逐渐坏死、干瘾最终皱缩。菌丝分枝，不产生厚垣孢子；孢囊梗简单，没有假轴式分枝，长140μm～525μm，平均310μm，孢梗顶端膨大形成孢子，孢子具半乳突，椭圆形至柠檬形，基部平截，具短柄，孢子囊没有层出现象。同宗配合，穿雄生,雄器扁球状，包藏在产卵器基部，藏卵器近球形，直径16.2 μm～35.6 μm，平均23.7μm。在利马豆组织上孢子囊(33μm～48 μm）×（18 μm～28 μm)平均39 μm×22μm，长宽比约为1.8：1;在利马豆培养基上，孢子囊稍小，平均34 μm×22μm,在培养基和植物组织上均能形成卵孢2 SN/T 3403-—2012子,卵孢子浅黄色,15 μm～28 μm。菜豆疫霉与利