SNT 2010-2007植原体脱除方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2010—2007植原体脱除方法 Method for elimination of phytoplasma2008-07-01实施2007-12-24 发布中华人民共和国发布表15国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 2010—2007前言本标准的附录 A、附录 B、附录 C、附录 D均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国上海出人境检验检疫局负责起草，中国检验检疫科学研究院参加起草。本标准主要起草人：杨翠云、于翠、魏梅生、赵文军、乔艳艳、陶庭典本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2010—2007植原体脱除方法1 范围本标准规定了植物种苗、鳞球茎和组培苗的植原体脱除及检测的基本原则和方法。本标准适用于进出境植物种苗、鳞球茎和组培苗的植原体脱除和检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1植原体phytoplasma寄生于植物韧皮部和介体昆虫体内的、具有三层单位膜结构的无细胞壁的原核生物。一般引起植物叶片的黄化和发育畸形等症状，对四环素族类抗生素敏感，而对青霉素不敏感。2.2外植体　explant用于植物组织培养的材料称为外植体，其主要形式有器官、胚胎、单细胞和原生质体等。2.3脱植原体苗phytoplasma -free microplant应用茎尖组织培养等技术获得再生的试管苗，经检测确认不带该种植物的有害植原体，可认定为脱植原体苗。3原理植原体形态一般有球形、椭圆形、长杆形、梭形、带状形和多态不规则形,大小为 50 nm～1 000 nm,其结构较病毒复杂，具有细胞结构，但没有细胞壁，被单位膜包裹，单位膜由两层蛋白质膜和中间一层脂膜组成，厚度约为10nm。在植物体内植原体主要分布在韧皮部，根尖和芽尖的分生组织内植原体含量少或不含植原体。在高温下可钝化植原体，明显减弱或抑制植原体在植物体内的繁殖。植原体对四环素族类抗生素敏感，而对青霉素不敏感。4仪器设备、用具及试剂4.1仪器设备超净工作台、光照培养箱、干燥箱、电子天平、微波炉等4.2　用具镊子、剪刀、酒精灯等。4.3主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯。乙醇、漂白粉、升汞、MS培养基试剂（见附录A）。5植原体脱除方法5.1茎尖培养脱除植原体5.1.1培养材料的灭菌处理将组织培养材料用流水冲洗于净，在凹凸不平处以及鳞片缝隙处用软刷等将污物彻底清除干净，最 SN/T 2010—2007后一次用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小块。在无菌条件下先在70%酒精中浸30 s～60s，再将材料移人漂白粉饱和溶液中浸5min～10min或0.1%升汞水中消毒 0.5 min～3min,最后用无菌水清洗 3次～4次,用无菌纸吸干水分。5.1.2植原体脱除的茎尖处理和培养在无菌的环境下，用无菌刀、剪、镊等将已消毒的工具，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等,将含有叶原基的茎尖组织切成0.1mm～1.0 mm的小段即外植体。立即将切好的外植体接种到 MS培养基(MS培养基制备方法见附录A。培养不同的植物需要在 MS培养基制作过程中添加不同比例的生长素和细胞分裂素，pH值为5.0～5.8)上，每瓶接种 4个～10个，接种后的瓶或管用无菌药棉或盖封口，培养血用无菌胶带封口。将接种好的材料放在温度25℃土1℃、光周期16h光照、8h黑暗、光照强度15001x～20001x的条件下的光照培养箱中进行培养。5.1.3组培苗的生长管理在组培苗的生长过程中及时进行植原体脱除效果评定，评定方法见第6章。剔除含有植原体的幼苗。5.2茎尖培养结合热处理脱除植原体将待处理的植物材料放人35℃～40℃的温箱内，根据植物不同需要处理几十分钟，甚至几十天。根据不同种类的植物，植原体脱除的热处理还可以选择50℃士1℃热水处理40min或80℃士1℃热水处理10 min。将热处理好的植物材料取出后进行消毒和茎尖培养，方法同5.1。在组培苗的生长过程中及时检测植原体脱除是否完全，植原体脱除效果评定见第6章，剔除含有植原体的幼苗。5.3茎尖培养结合化学处理脱除植原体茎尖培养结合化学处理的基本方法同5.1,只需在MS培养基中加入100mg/I.～500mg/L四环素。对四环素敏感的植物不可采用该方法。在组培苗的生长过程中及时检测植原体脱除是否完全，植原体脱除效果评定见第6章，剔除含有植原体的幼苗。6植原体脱除效果评定经脱除植原体的植株，需进行PCR方法检测（见附录B)。如果PCR检测结果为阴性，即可判断植原体脱除完全；如果PCR检測为阳性，再进行荧光显微镜观察（见附录C)或电子显微镜观察（见附录D)，如果任一方法观察到植原体的粒体，即可判断该植株的植原体脱除不完