SN 1420-2004昏眩病诊断操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1420—2004昏眩病诊断操作规程Protocol of diagnosis for whirling disease2004-06-01发布2004-12-01 实施中华人民共和国发布效码防伪国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1420--2004前言本标准的附录 A、附录 C、附录 D 均为规范性附录,附录 B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：吴小伦、薄清如、黄建珍、赖子平、兰乃洪。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1420-2004昏眩病诊断操作规程1范围本标推规定了昏眩病的诊断操作规程。本标推适用于进出口鲑鳟鱼的昏眩病检验检疫。2 材料2.1仪器设备普通天平，分析天平，普通离心机，微型振荡器，水浴锅，振荡水浴装置，普通显微镜，血球计，pH试纸,研钵，解剖刀,镊子，烧杯，玻片，离心管，可调移液管等。2.2试剂漂白粉，10%福尔马林，1%孔雀绿，70%、80%、90%、95%、100%酒精，二甲苯，姬姆萨染色液（见附录A），胃蛋白酶液(0.5%）（见附录A），酪蛋白酶液（0.1%）（见附录A），0.1mol/L氢氧化钠，10%牛血清蛋白，磷酸盐缓冲液(PBS）（见附录A),甲醇,丙酮。所有化学试剂均为分析纯。3 昏眩病诊断3. 1 临床症状病鱼作狂乱追尾运动，特别当喂食或被惊吓时症状加剧。在冷水条件下，旋转运动的临床表现通常发生在感染后2个～3个月，并可持续长达一年。2月龄～8月龄的病鱼，躯于后部和尾部呈黑色。昏眩病后期的病鱼鳃盖骨萎缩，鳃裸露在外，下颌骨畸形，脊椎弯曲，眼后头盖骨严重凹陷，这种鱼染病三年后仍带有病原体。3.2寄生虫检查3.2.1病原体形态该病病原体为脑粘体虫（Myrosoma cerebraLis）。脑粘体虫的孢子大小为（6.5 μm～7 μm）×（7.5μm～8μm)，微卵形，侧面观似小扁豆;有两个梨形极襄，孢质中有两个圆形的胚核，一条无缝合脊的明显可见的缝合线，无嗜碘泡（参见附录B）。3.2.2采样采样原则选择有临床症状的鱼作寄生虫检查，若无症状，可根据鱼的数量随机抽样检查。采样数量对有症状的鱼取 5 尾～10 尾作寄生虫检查,或对无症状鱼群则按表 C.1 进行抽查。3.2.3涂片检查将头部纵切开，观察耳区软骨组织中有无胞囊(乳白色，直径为1 mm～2 mm)。若有胞囊，取-小块胞囊放在载玻片上，压碎，用450倍～600倍显微镜检查，观察是否有脑粘体虫孢子。如果没有发现胞囊,则从耳石区将软骨组织切开,刮取内含物作涂片检查。左右耳石区都需检查。上述两项检查都未发现孢子，可按3.2.4检查。3.2.4涂片染色检查将可疑鱼的头部割下并纵切开,45℃水中孵育 1 min～3 min,将松散的肉和脑移到废物容1 SN/T 1420—2004器(水和家用漂白剂比例为1：1)消毒，从脑壳、耳石、鳃拱处收集骨和软骨样。用等体积的10%福尔马林于研钵磨碎样品。用水将所有磨碎样冲入小烧杯并使物质沉淀。涂5滴～10滴沉淀物到干净的显微镜玻片上，空气干燥。1%孔雀绿染色5min，流水冲洗，并将玻片依次放置于70%、90%、100%酒精中各30s，脱水脱色。200×镜检。观察是否存在具有深绿色极囊的绿色卵形虫体。3.2.5切片检查将头保存在10%的中性缓冲福尔马林液中约3d。 除去石灰质后,流水冲洗 4 h～5 h。用70%、80%、95%、100%酒精脱水，其中95%、100%酒精重复两次。各级酒精脱水的时间约 45 min～60 min,然后用二分之一100%酒精加二分之一二甲苯脱水 30 min～45 min,再后人二甲苯直到组织透明为止约15 min～30 min。用石蜡包埋。切成5 μm～7 μm的切片。姬姆萨染色（见附录D)。200×镜检观察孢子和营养体。3.3综合判定3.3.1出现上述临床症状,又检查到脑粘体虫的孢子或营养体,则判定为昏眩病。3.3.2未出现上述临床症状,但检查到脑粘体虫的孢子或营养体,也判定为昏眩病。 SN/T 1420--2004附录A(规范性附录)试剂配制A.1 PTD 法试剂的配制A.1.1胃蛋白酶液(0.5%):5.0 g 胃蛋白酶,5 mL浓盐酸,1 L去离子水。A.1.2酪蛋白酶液(0.1%):0.2 gEDTA,8.0g氯化钠,0.2 g氯化钾,0.2 g磷酸二氢钾,5.0 g酪蛋白酶,1.5 g磷酸二氢钠,1 L去离子水。A.2磷酸盐缓冲液(PBS)的配制PBS缓冲液(pH7.2～7.4):8.01g氯化钠,0.20g氯化钾,0.61g磷酸氢二钠,0.19 g磷酸二氢钾,1 L去离子水。A.3姬姆萨染色试剂的配制