SN_T 2770-2011国境口岸军团菌荧光PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2770—2011国境口岸军团菌荧光PCR检测方法Detection of Legionella with real-time PCR at frontier port2011-07-01实施2011-02-25发布中华人民共和国X发布数国防价国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准国境口岸军团菌荧光PCR检测方法SN/T 2770--2011*中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 www. spc. net. cn电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×1230 1/16印张 0.5字数 9 千字2011年6月第一版2011年6月第次印刷印数 1—1 600*书号：155066·2-22053 SN/T 2770—2011前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中国疾病预防控制中心。本标准主要起草人：章琪、田桢干、方筠、何宇平、李晓虹、陈建雄、高璟瑜、邵祝军、郑剑宁、陶国宏、宋诚本、宋锋林、熊焕昌。 SN/T 2770—2011国境口岸军团菌荧光PCR检测方法1范围本标准规定了国境口岸军团菌荧光PCR检验的对象、检测方法及结果报告。本标准适用于军团菌的筛选检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T 2351　出人境口岸军团菌检验规程WS 195军团菌诊断标准及处理原则WS/T 230　临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用3术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1军团菌 Legionella军团菌属革兰氏阴性杆菌，军团菌科（Legionellaceae），属于军团菌属，现已发现50余种，70多个血清型，至少有20种可引起人感染。兼性需氧，无芽孢，无荚膜,军团菌生长一般需要半胱氨酸和铁。4检测对象4.1待检军团菌疑似阳性菌落。4.2疑似军团菌感染的临床标本如咽拭子、肺组织、支气管灌洗液、血液、痰、胸水、胸腔引流物等。4.3国境口岸疑似环境污染样品，如集中空调通风系统的冷却水、冷凝水，管道饮用水及其形成的沉积物、软泥等环境样品和出人境交通工具空调通风系统冷却水、冷凝水和管道饮用水。5 检测5.1准备实验室准备检验设备和材料，所需设备和材料参见附录A。实验室生物安全应符合GB19489的规定。PCR防污染措施按WS/T230要求。5.2实验室检验5.2.1样品采集疑似军团菌感染的临床标本和环境污染标本采集按照SN/T2351执行。 SN/T 2770--20115.2.2样品处理培养基上疑似菌落5.2.2. 1用无菌接种环从平板上挑取军团菌疑似菌落进行转种，然后收集菌体，混悬于100μL的灭菌或无菌双蒸水或纯水中，模板提取见5.2.3。[临床标本直接从咽拭子和肺组织、支气管灌洗液、血液、痰、胸水、胸腔引流物等临床标本中提取模板时，可取样本物不少于·200μL或200 mg(痰标本和支气管洗液应进行必要的酸处理）,加人 1mLpH7.4 PBS混匀，2000r/min离心5min，收集上清液于~15-mL-离心管-10-000-rmim离心5min，吸去上清液；沉淀物用于模板提取见5.2.3。环境水样将300 mL～1000 mL水样用0.2μm滤膜过氵滤,取滤膜悬浮于1 mL～5mL蒸馏水中,剪碎滤膜并放于无菌试管中,再加人 3 mL灭菌水。振荡混匀。吸取浓缩好的样本以 8 000 r/min 离心10 min～15min集菌，弃上清液，沉淀物用于模板提取见5.2.3。5.2.3模板DNA制备加热处理法在沉淀物中加人 50 μL～100μL超纯水,振荡混勾,100℃煮沸10min，置冰上数分钟，待冷却后，1200 r/min离心5min，上清液即可作为扩增模板。上清液可转移并保存在一20℃备用。酚/三氯甲烷DNA提取法在沉淀物中加人700 μLDNA提取液（配方参见附录A)，100 ℃煮沸10 min，加酚/三氯甲烷（1：1，体积比)700μL，振荡混匀,12000r/min离心5min,取上清液至另一离心管中，加人等量无水乙醇沉淀DNA,12000r/min离心5min，