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多肽合成中二硫键形成方法的研究进展 这两个半胱氨酸残基的侧链在维持氨基酸和蛋白质的空间结构和生物活性方面发挥着重要作用。研究二硫键形成的方法一直是多肽合成方法学研究的热点和难点之一。 形成二硫键的实质是两个游离的巯基经氧化后形成硫-硫共价键。从化学反应机理上讲,这是一个自由基反应 在多肽合成中,二硫键的形成要复杂得多。由于多肽分子量较大,空间结构较复杂,它要求两个半胱氨酸在空间距离上接近。半胱氨酸的巯基非常活泼,容易产生副反应,多肽分子中的某些残基易被氧化或修饰,因此还需要选择合适的氧化剂。此外,其反应机理也比较复杂,既可能是游离基反应,也可能是离子反应 采用温和的氧化剂,如空气、二甲亚砜(DMSO)、N-碘代琥珀酰亚胺(NIS)和氰化碘(ICN)等氧化得到热力学控制的产物。采用较强的氧化剂,如碘、铁氰化钾[K 本文对多肽合成中二硫键形成的各种方法作一介绍。 1 -二硫醇形成方法 1.1 加压素和胰岛素的制备 空气氧化法形成二硫键是多肽合成最经典的方法。在催产素、加压素和胰岛素的早期合成中,采用空气氧化法形成二硫键都取得了较好的效果 在碱性溶液中难溶的富含精氨酸的肽或疏水性较强的肽以及在碱性溶液中易被破坏的肽,不宜采用空气氧化法 1.2 铁氰化钾氧化法 铁氰化钾氧化法也是多肽合成中常用的一种形成二硫键的方法 Hope 1.3 碘氧化法 碘氧化法在多肽合成中的应用比较广泛 碘可以直接将含有Cys(Acm)和Cys(Trt)的肽氧化形成二硫键 1.4 三氟乙酸氧化法 Fujii等 1.5 二甲基硝酸dmso氧化法 二甲亚砜是一种温和的氧化剂。采用二甲亚砜氧化形成二硫键是近年来引入多肽合成的一种新方法 1.5.1 cys侧链保护基的多肽 采用10%DMSO/TFA可在脱除侧链保护基的同时氧化含有Cys(Trt)、Cys (4-MeOBzl)、Cys(Dbs)和Cys(Bzh)的多肽形成二硫键。对含后三种Cys侧链保护基的多肽,一般在25℃反应12小时即完成脱保护及氧化。在相同条件下,对含Cys(Ad)和Cys(4-MeBzl)的多肽,不能采用此法氧化。被氧化多肽链中的,Trp需要进行保护,Met可能部分被氧化成Met(O)。对于含Cys(Trt)或游离出半胱氨酸巯基的多肽,氧化反应可在1小时内完成。Otaka等 1.5.2 氧化so水溶液 DMSO可以与水混溶形成混合溶剂。通常用20%DMSO水溶液氧化速度比较合适,反应需1～4小时。此反应可在较大pH值(3～8)范围内进行,对碱性或疏水性强的肽尤其适合。此法对Met、Trp和Tyr无影响。 1.6 氯-亚氧化法 Numata等 1.7 碘acm氧化机理 NIS可以直接氧化。该反应有两种机理:NIS对Cys(4-MeOBzl)的氧化是自由基反应;NIS对Cys(Acm)的氧化则通过亲电取代,首先形成RSI,再进一步形成二硫键(RSSR)。此反应与碘氧化机理不同,因为碘能直接氧化Cys (Acm),但不能直接氧化Cys(4-MeOBzl)。Bishop 1.8 氰化碘氧化法 ICN易溶于水和有机溶剂的混合溶剂。如在CH 1.9 3盐氧化法 在甲醇-水溶液或三氟乙醇-水溶液中,用10 mol·L 1.10 -py水生植物 3-硝基-2-吡啶硫基(3-nitro-2-pyridylsulfenyl,Npys)作为巯基保护基团,对强酸(如HF和TFA)稳定,适合用于Boc/苄基保护策略 2 稳定性构象的选择 在多肽合成中往往需要形成两对或多对二硫键,可采用一步氧化法和分步氧化法实现。2.1一步氧化法 选择合适的氧化条件,可一步氧化形成两对或多对二硫键的正确配对结构,该结构往往就是具有热力学稳定性天然构象。Tam等 2.2分步氧化法 若需要选择性形成两对或多对二硫键,可采用两组或多组不同的巯基保护基,利用其性质差异,分步氧化形成两对或多对二硫键。如某肽链中结构有四个半胱氨酸Cys1、Cys3、Cys11和Cys15,需分别在1、15位和3、11位之间形成两对二硫键。可在1、15位选用Cys(Acm),在3、11位选用Cys(4-MeBzl)。首先用HF脱保护,游离出3、11位的半胱氨酸巯基,以铁氰化钾氧化形成3、11位二硫键,然后采用碘氧化形成1、15位二硫键。Tamamura等 3 合成肽的序列特点 空气氧化法、铁氰化钾氧化法和碘氧化法是多肽合成应用最广泛的经典方法。DMSO氧化法、三氟乙酸铊氧化法、氯硅烷-亚砜氧化法和Npys氧化法均是近年来引入多肽合成中的新方法,其应用越来越多。氰化碘氧化法、NIS氧化法及锍盐氧化法尚处于研究探索中,在多肽合成中应用尚不多见。 二硫键的形成一直是多肽合成中的一个难点,目前尚无一种既简便又满意的方法。但从本文介绍的多种方法中,根据合成肽的序列特点,总能选