SN 1467-2004小鹅瘟病毒分离和琼脂免疫扩散试验方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1467—2004小鹅瘟病毒分离和琼脂免疫扩散试验方法Method of virus isolation and agar-gelimmunodiffusion testfor gosling plague2005-04-01实施2004-11-17 发布中华人民共和国发布数码防伪国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1467-2004前言本标准的附录A为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。本标准主要起草人：李超美、罗朝科、朱雪良、刘学辉、王成龙。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1467—2004小鹅瘟病毒分离和琼脂免疫扩散试验方法1范围本标准规定了小鹅瘟病毒分离和琼脂免疫扩散试验方法。本标准适用于病毒分离鉴定和小鹅瘟病毒抗体的检测。2 病毒分离2.1材料准备2.1.1仪器设备超净工作台、普通离心机、小型孵化箱或培养箱、灭菌剪刀、镊子、三角烧瓶、玻璃研磨器、离心机、吸管(1 mL、2 mL5 mL、10 mL)。2. 1.2试剂 蒸馏水。 PBS 液(见第 A.1 章)。青霉素、链霉素（见第A.2章）、三氯甲烷（分析液）。SPF 鹅胚或番鸭胚。2.2 病料及处理2.2.1 取病料取可疑小鹅瘟病雏鹅或死亡雏鹅,无菌操作取肝、胰、脾、肾、脑等内脏器宫病料放置灭菌的玻璃瓶冻结保存(一20℃)作为病毒分离。2.2.2初步处理先将病料组织剪碎、研磨，用灭菌 PBS液作1：5～1：10稀释,经3000 r/min 离心30 min,取上清液加人青霉素和链霉素，使之各含1000 IU/mL,置37℃温箱中 30min,经细菌检验为阴性者作为病毒分离材料。2.3胚胎接种2.3.1鹅胚接种将上述病毒分离材料通过尿囊腔分别接种6枚12日龄易感鹅胚，每胚0.2ml,置37℃～38℃孵化箱内继续孵化,每天照胚2次～4次，观察9d，一般经5d～7d大部分胚胎死亡，弃去 48 h 以内死亡的胚胎，收集48h以后死亡的鹅胚，放置4℃～8℃冰箱内冷却收缩血管。无菌操作吸取尿囊液保存和作无菌检验，并观察胚胎病变。无菌的尿囊液冻结保存（一70℃)作传代及检验用。2.3.2番鸭胚接种将上述病毒分离材料接种6枚12日龄易感番鸭胚，每胚尿囊腔接种0.2mL，置37℃～38℃孵化箱内继续孵化,每天照胚 2次～4 次，观察 9 d,一般经 5 d～9 d大部分胚胎死亡。弃去 48 h 死亡的胚胎，收集48h以后死亡的番鸭胚，放置4℃～8℃冰箱内冷却收缩血管。无菌操作吸取尿囊液保存和作无菌检验,并观察胚胎病变。无菌的尿囊液冻结保存(一70℃)作传代及检验用。2. 3. 3胚胎病变由本病毒致死的鹅胚和番鸭胚具有相同的大体肉眼病变。绒毛尿囊膜增厚，全身皮肤充血，翅尖、趾、胸部毛孔、颈、喙旁均有较严重出血点，胚肝充血及边缘出血，心脏和后脑出血，头部皮下及两肋皮下 SN/T 1467—2004水肿。接种后7d以上死亡的鹅胚和番鸭胚胚体发育停顿,胚体小。2.4病毒鉴定本标准使用琼脂扩散试验来做小鹅瘟病毒鉴定，方法见3.1.6和3.2.2。3琼脂扩散试验3.1材料准备3.1.1试剂氯化钠、硫柳汞、优质琼脂粉、三氯甲烷、聚乙二醇(MW20000)。3.1.2器材注射器、离心机、天平、透析袋、振荡器、金属打孔器(孔径 6 mm,孔距4 mm)、吸管、量筒、玻璃平血（100×15mm）、三角烧瓶和模板纸（见图1）。20g.626358图1琼扩试验结果判定示意图3. 1. 3 诊断试剂标准抗原由生产商提供，按说明书使用。标准阳性血清由生产商提供，按说明书使用。标准阴性血清由生产商提供,按说明书使用。3.1.4被检血清制备翅静脉采血，常规分离血清,并按0.01%量加入硫柳汞防腐，可在4℃保存5d或冻结保存待检。3.1.5被检鹅卵卵黄的处理用注射器（不带针头）吸取20mL新鲜鹅卵黄于盐水瓶中，加人等量生理盐水充分振荡均匀，再加2 SN/T 1467--2004人20 mL三氯甲烷振荡30min后，以3500 r/min离心30 min，取上清液（约20mL)装人透析袋内，置40%聚乙二醇中浓缩(约 6 h～12 h)至 1 mL～2 mL,吸出浓缩液并用 1 mL～2 mL 生理盐水洗透析袋，吸出合并于浓缩液中，控制最终浓缩倍数5倍。最后以3500r/min离心30min，取上清液并加0.01%硫柳汞防腐,冻结保存(一20℃)待检。3.1.6被检琼扩抗原制备将分离毒株鹅胚尿囊液，经3000r/min离心30min，取上清液加人等量三氯甲烷振摇30min后，经3000r/min离心30min。取上清液装人透析袋，置于有干燥硅胶的密闭玻璃缸（或玻璃瓶）内数小