SN_T 4291-2015猴免疫缺陷病毒斑点酶免疫检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4291—2015猴免疫缺陷病毒斑点酶免疫法检疫技术规范Quarantine protocol for simian immunodeficiency virus with dotimmunobinding assay2015-09-02发布2016-04-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4291—2015前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广西出人境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检疫局、苏州西山生物技术有限公司。本标准主要起草人：罗兆飞、温和心、陈立军、刘军义、盘宝进、罗广生、韦梅良、艾军、时长军、郭连香。- SN/T4291—2015猴免疫缺陷病毒斑点酶免疫法检疫技术规范1范围本标准规定了实验猴猴免疫缺陷病毒（SIV)斑点酶免疫法实验室检测的操作程序和技术要求。本标准适用于实验猴猴免疫缺陷病毒（SIV)的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实验猴labprimates人工饲养，对其携带的微生物实行控制，遗传背景明确或者来源清楚的，用于科学研究、教学、生产、检定及其他科学实验的非人灵长类动物，如食蟹猴、猕猴等。3.2斑点酶免疫法去 enzyme-linked immunospot assay将抗原吸附到硝酸纤维膜上，将吸附了待检血清的滤纸盖在抗原点上，样本中病毒抗体和膜上的抗原发生特异结合，然后加入酶标二抗反应，最后加人底物显色，使特异的抗原-抗体-酶结合物点呈现肉眼可见的红色斑点，以定性检测病毒抗体.4缩略语下列缩略语适用于本文件。SIV：猴免疫缺陷病毒（simianimmunodeficiencyvirus）5设备和材料5.1恒温培养箱或水浴箱：37.0℃。5.2跷跷板式摇床或酶标板摇床。5.3涡旋振荡器。5.4可调移液器及吸头。5.5电子分析天平：精度0.1mg。5.6载样条：宽0.5cm，长1cm的小滤纸条。1 SN/T4291—20155.7渗滤垫：大小为9cm×9cm的厚滤纸。5.8尖头镊子。5.9大小为9cm×9cm方形塑料平皿。6试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子水。注：不同试剂盒制造商的产品应严格按照其说明书要求操作，本标准以猴免疫缺陷病毒斑点酶联免疫检测试剂盒（VRL)1盒中的试剂及配制为例。6.1预点SIV抗原的硝酸纤维抗原膜。6.20.1mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液母液（10×PBS）：称取80gNaCl,29gNazHPO4·12HzO,2gKCl,1.9gKHzPO4，加水至1L,充分溶解。6.3磷酸盐缓冲液（1×PBS）：取100mL10×PBS，加900mL水，混匀。6.4样本稀释液：称取5g脱脂奶粉，加PBS至100mL。6.5洗涤液（0.1%PBST）：往1L1×PBS中加1mL吐温-20，混匀。6.60.2mol/L pH8.0 Tris缓冲液:称取11.34g Tris 粉末,加水至400mL。6.7显色剂A：称取15mg4-氯-2-甲基重氮苯1，5-萘二磺酸盐（耐晒红TR盐），加Tris缓冲液至5mL，充分溶解，即用即配。6.8显色剂B:称取2mg茶酚，加水至5mL。6.9酶标二抗：取10μL碱性磷酸酶标记的羊抗猴IgG抗体加人10mLPBS中作1：1000稀释作为工作液。6.10终止液（0.1%EDTA）：称取1gEDTA，用去离子水稀释，定容至1000mL，室温保存。6.11 阳性对照血清。6.12阴性对照血清。7检验方法7.1样品处理采集静脉血1.5mL，分离血清备用。7.2操作步骤7.2.1血清稀释：用样本稀释液将样品和阴性、阳性血清作1：5稀释，涡旋混匀。7.2.2准备膜：取出抗原膜，编号后置于平皿中，加入15mL样本稀释液，置摇床上慢速摇动，室温封闭30min，结束后将膜用1×PBS快速洗涤三次，每次1min，最后弃去洗液，然后在抗原膜下垫人一张渗滤垫，注人少许0.1%PBST，确认膜和滤纸充分湿润，再倒出多余液体，直至膜上不挂液为止。7.2.3贴膜：用尖头镊子轻夹一片载样条，将一端小心浸人样品稀释液中，待载样条吸附上液体后提出液面，并将纸条在试管口轻刷1次～2次，去掉多余的液体，然后贴覆在抗原膜上。用吸水纸擦干镊尖，再贴下一个样本。7.2.4孵育：每张膜贴好后，