赤雹根总皂苷对fca诱导性关节炎大鼠肿瘤坏死因子-表达的影响.docxVIP

赤雹根总皂苷对fca诱导性关节炎大鼠肿瘤坏死因子-表达的影响 赤雨根具有苦味性寒、活血、消除充血、清热解毒的功效。这是辽宁省常见的满族药品。它经常被用来治疗风湿性腰椎和软组织损伤，疗效显著，无明显毒副作用。 1 材料和方法 1.1 免疫组化试剂盒 TSTR提取所用赤雹根, 经承德医学院赵春颖教授鉴定为葫芦科植物赤雹的干燥块根, TSTR由承德医学院中药研究所药理实验室提取, 纯度为55.2%;雷公藤多苷 (TG) 片 (安徽新陇海药业有限公司, 批号100301) ;酶联免疫吸附试验 (ELISA) 试剂盒 (武汉博士德生物科技有限公司, 批号EK0526) ;弗氏完全佐剂 (FCA, 美国Sigma公司, 批号100M8725) ;聚合酶链反应 (PCR) 试剂盒 (大连宝生物工程有限公司, 批号BK4501) ;PCR扩增引物 (美国Invitrogen生命技术公司, 批号HB120706536) ;兔抗鼠TNF-α一抗 (美国Bioworld公司) ;免疫组化试剂盒 (北京四正柏生物科技有限公司) ;其他试剂均为国产分析纯。 1.2 紫外分光光度计和icycarrpcr检测 CSR-1-30型超纯水机 (北京爱思泰克科技开发有限责任公司) ;YXQ-LS-30 SⅡ立式压力蒸汽灭菌器 (上海博迅实业有限公司医疗设备厂) ;DU800紫外可见分光光度计 (美国Beckman Coulter公司) ;i Cycler PCR仪 (美国Bio-rad公司) ;SIM-F124制冰机 (日本SANYO公司) ;ESJ200-4电子天平 (沈阳龙腾电子有限公司) ;TK-218型恒温摊片烤片机 (湖北泰维医疗科技有限责任公司) ;YKH-I型液体快速混合器 (江西医疗器械厂) ;RM2125型常规轮转石蜡切片机 (德国Leica公司) ;BH-2型Olympus显微镜及摄像装置 (日本Olympus公司) 。 1.3 菌株:scxk SPF级, 雄性8周龄SD大鼠60只, 体重180~200 g, 购自北京华阜康生物科技股份有限公司, 合格证号:SCXK京2009-0007。 1.4 方法 1.4.1 fca的注射效果 随机数字表法取大鼠10只作为空白组, 其余大鼠均于右后足跖部皮下注射FCA0.1 ml, 以注射点周围出现明显白泡为效果最佳, 于注射FCA后第18天, 关节炎指数 (AI) ≥6为模型建立成功。AI评判标准:肢体关节肿胀按0~Ⅳ级评分 1.4.2 灌胃药物的给予 将模型大鼠随机分为模型组、TSTR 40, 80, 160 mg/kg组和TG 12 mg/kg对照组, 各药物组均灌胃给予相应药物21 d, 空白组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃。 1.4.3 血清离心 腹主动脉取血, 静置30 min以上, 3 500 r/min离心10 min, 取上清, 将血清注入EP管中4℃保存备用。按照ELISA试剂盒说明书检测血清TNF-α含量。 1.4.4 pcr检测na表达 取新鲜足趾100~200 mg, 加入1 ml Trizol, 置于匀浆器中, 冰上充分研磨, 匀浆液于离心机 (4℃、12 000 r/min, 15 min) 离心后, 取上清液, 加入0.2 ml三氯甲烷, 剧烈震摇30 s, 静置5 min;同等条件再次离心后, 小心吸取上清水相液 (勿吸入中间蛋白层) , 加入等体积异丙醇, 上下缓慢颠倒几次, 使之混匀, -20℃冰箱静置2 h后, 冰上放置5 min;再次相同条件离心, 留取管壁侧部和底部的白色RNA沉淀, 用75%乙醇[0.1%焦碳酸二乙酯 (DEPC) 水配制]1 ml, 洗涤沉淀, 重复3次, 将洗涤后的RNA溶于20μl DEPC水中, 放置-80℃冰箱, 保存备用。取少量待测RNA样品, 用DEPC水稀释100倍, 紫外分光光度计测定RNA纯度, 琼脂糖凝胶电泳法检测RNA完整性, 反转录合成cDNA (反转录程序为:30℃, 10 min;42℃, 30 min;99℃, 5 min;5℃, 5 min) 产物cDNA于-20℃保存。PCR扩增程序为:94℃预变性2 min, 94℃变性30 s, 57℃退火30 s (不同目的因子采用相应的退火温度) , 72℃延伸1 min, 共30个循环, 产物于-20℃保存。TNF-α上游引物5apos;-CGTCGTAGCCAAACCACCAAG-3apos;, 下游引物5apos;-CACAGAGCAATGACTCCAAAG-3apos;, 扩增长度426 bp, 退火温度57℃;β-actin上游引物5apos;-CATCCTGCGTCTGGACCT-3apos;, 下游引物5apos;-TCAGGAG-GAGCAATGATC