NY_T 2473-2013结球甘蓝品种鉴定技术规程 SSR分子标记法.pdf

ICS 65.020.01B 04NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2473-2013结球甘蓝品种鉴定技术规程SSR分子标记法Protocol for identification of cabbage varietiesSSR marker method2013-12-13 发布2014-04-01实施中华人民共和国农业部发布 - NY/T 2473--2013目次前言范围-2规范性引用文件3原理4仪器设备及试剂5 溶液配制引物6参照品种及其使用操作程序89等位基因数据采集10判定标准附录A(规范性附录）主要仪器设备及试剂溶液配制附录B(规范性附录)附录C(规范性附录)核心引物..F NY/T 2473—2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由农业部种子管理局提出。本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会（SAC/TC277)归。本标准起草单位：农业部科技发展中心、中国农业科学院蔬菜花卉研究所。本标准主要起草人：庄木、堵苑苑、张扬勇、王庆彪、方智远、杨丽梅、刘玉梅。Ⅱ NY/T 2473—2013结球甘蓝品种鉴定技术规程SSR分子标记法1 范围本标准规定了利用简单重复序列(SSR)分子标记进行结球甘蓝（BrassicaoleraceuL.var.capitatα）品种鉴定的试验方法、数据记录格式及判定标准。本标准适用于结球甘蓝品种的DNA指纹数据的采集和DNA指纹鉴定。.2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件.其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19557.1植物新品种特异性、-致性和稳定性测试指南总则3原理简单重复序列(SSR)分布于结球甘蓝整个基因组的不同位置上，不同品种每个位点上重复单位的数且及序列可能不同。由于每个简单重复序列两侧的序列是高度保守和单拷贝的，因而可根据其两侧的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对重复序列进行扩增，得到的PCR产物在电泳过程中的电荷效应作用下得到良好的分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记检测区分开。由于不同结球甘蓝品种遗传组成不同，所以，根据引物DNA序列存在差异或引物结合部位之间的DNA片段大小存在差异.即可鉴定结球甘蓝品种。4仪器设备及试剂仪器设备及试剂见附录A。5溶液配制本标准所用试剂为分析纯，所用水应符合GB/T6682中规定的要求。溶液配制方法见附录B。6 引物基本核心引物见附录C。+7参照品种及其使用参照品种的名称见附录C。在进行等位变异检测时，应同时包括相应参照品种的PCR扩增产物。注1：多个品种在某一SSR位点上可能都具有相同的等位变异。在确认这些品种该位点等位变异大小与参照品种相同后，这些品种也可以代替附录C中的参照品种使用。注2：同-·名称不同来源的参照品种的某·位点上的等位变异可能不相同，在使用其他来源的参照品种时，应与原参照品种核对，确认无误后使用对于附录C中未包括的等位变异，应按本标准方法，确定其大小和对应参照品种。8操作程序8.1样品准备1 NY/T 2473—-20138.1.1送检样品可为种子、幼叶或其他组织。8.1.2每份样品中至少随机抽取10个个体。混舍分析。对--致性差的样品，应分别随机抽取20个以上的个体，每个个体单独分析。8.2DNA提取提取DNA可采用以下方法：a)选取适量（0.2g左右）植物组织置于2.0ml.离心管中，用液氮研磨至粉末；b)离心管中加入700uI.预热2%CTAB缓冲液，轻摇混匀：c）65℃水浴15min，每隔5min轻摇1次；d)冷却后加人700uL氯仿异戊醇（24：1）混合液，混勾5min；e)12000g离心15min；f)吸取上清液到2mL的离心管中，加入700ul.预冷异内醇，混匀后放4℃沉淀1h；12 000 g离心 15 min;g)h)弃上清，75%乙醇洗涤后晾干；i)加人300μl.ddHO.6uI.RNAase.37℃水浴1hj）待充分溶解后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度：k)稀释成L作液或一20℃保存备用。注：以上为推荐的-种DNA提取方法。所获IDNA质量能够符合PCR扩增需要的DNA提取方法都适用于本标准。8.3PCR扩增8.3.1反应体系反应液体积为20uL，反应组分配制见表1。DVA分析仪检测时使用荧光标记的正向引物，每种引物的荧光染料种类见附录C。表 1 PCR扩增反应体系终浓度反应组分反应体积(μlL)11x10×Buffer（含氯化镁15mmol*L）dNTP(2. 5 mmol, I. cach)200 μmol