SN_T 2568-2010番茄细菌性溃疡病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2568—2010番茄细菌性溃疡病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp.michganensis(Smith)Jenen2010-12-01实施2010-05-28发布.中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局电码防份 SN/T2568—2010前言本标推按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标翟起草单位：中华人民共和国新疆出入境检验检疫局、中华人民共和国甘肃出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张祥林、刘、王、赵文军、王有福。T SN/T 2568--2010番茄细菌性溃疡病菌检疫鉴定方法1 范围本标准规定了番茄细菌性溃疡病菌[Clauibactermichiganensis subsp.michiganensis（Smith）Davis etal的检疫鉴定方法。本标准适用于进出境番茄种子及其产品中番茄细菌性溃疡病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1538.1培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则SN/T1809进出境植物种子检疫规程3原理番茄细菌性溃疡病菌的分类地位属于厚壁菌门（Firmicutes）、厚壁菌纲（firmibacteria）、真细菌目（Enterobacteriaceae）、棒形杆菌属（Ciauibacter）。该病菌的生物学特性（参见附录A）、血清学特性和分子生物学特性是制定本标准的主要依据。4仪器设备和用具4.1仪器设备电子天平（感量1/1000g）、真空泵、恒温培养箱、恒温振荡培养箱、高压灭菌器、超净工作台、生物显微镜（具照相系统）、高速冷冻离心机、Mini个人离心机、纯水器、恒温水浴锅、低温冰箱、酶标仪、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析仪等。4.2用具培养皿、试管、可调式微量进样器（2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）及相应的进样器头、研钵、96孔酶联反应板、离心管（1.5mL、10mL）、PCR管（0.2ml.）、量筒、烧杯。5试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB6682中一级水的规格。培养、鉴定番茄细菌性溃疡病菌所用的试剂见附录B、附录C和附录D。1 SN/T2568—20106检疫鉴定方法6.1常规生物学检测6.1.1田间调查及植株检验番茄细菌性溃疡病在田间所表现的症状参见附录A。田间调查时采集具可疑症状的植株或果实带回实验室，用清水冲洗干净，晾于后用灭菌的解剖刀在病健交界处取一小块病变组织，悬浮于少量无菌水中，用无菌玻棒挤压，然后用接菌环蘸取菌悬液，在523培养基平Ⅲ上划线分离，28℃恒温培养72h，番茄细菌性溃疡病菌在523培养基上培养3d可形成表面光滑、粘稠状、淡黄色至黄色的圆形菌落。根据番茄细菌性溃疡病菌的菌落特征选取可疑菌落做进一步鉴定。也可用发病果实或茎秆作ELISA或PCR检测实验。6.1.2种子检验随机抽取30g（≥10000粒）番茄种子为一份样品（少于30g的番茄种子样品则金部抽取，具体抽样要求参见SN/T1809的规定，加150mL预冷的0.05mol/L、pH7.2的磷酸-吐温缓冲液（PBT）。摇匀使种子完全湿润，在室温真空条件下解育30min~6Gmin，慢慢恢复常压；或在4℃下磁力搅拌器上搅24h~48h，取50ml.样品抽提液，12000g离心iomin浓缩，舜上清液，沉淀用0.01mol/LpH7.2磷酸缓冲液（PB)重新悬浮，制成样品浮液，终体积为2mL，将其均分为两份，其中1份做分离培养检验，另1份加10%甘油保存，以便作ELISA或PCR检测实验。在每个KBT培养基或KBP培养基平板上各加50μL样品悬浮液，用灭菌玻璃棒涂布，每个样品至少要用2个平Ⅲ。在另外的平皿上接种标准番茄细菌性溃疡病菌得到阳性对照菌落。25℃培养4d后开始出现番茄细菌性溃疡病菌菌落。在KBT培养基上菌落圆形、隆起深灰白色、边缘黄至琥珀色；在KBP上菌落为淡黄色。6d时检查乎Ⅲ，并将可疑落转移到普通培养基（如：NA培养基）上进行纯化、培养。有些番茄细菌性溃疡病菌菌株在选择性培养基其生长较慢，为了使这些菌落充分表现，应将原始平血再继续培养3d以上，用双抗体寒心酶联免疫吸附法或PCR法作进一步鉴定。上述几种培养基的配方见附录B。6.2双抗体夹心酶联免疫吸