SNT 2271-2009青椒中转基因成分定性PCR检测方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2271-2009青椒中转基因成分定性PCR检测方法Method of the ploymerase chain reaction for detecting genetically modifiedcomponents in pimiento2009-02-20 发布2009-09-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局散码风防优 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准青椒中转基因成分定性PCR检测方法SN/T 2271--2009中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址 www. spc. net. cn电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷?开本880×12301/16　印张0.5字数 ９千字2009年5月第一版2009年5月第次印刷印数 1 --2 000*书号：155066·2-19658 SN/T 2271—2009前言本标准由国家认证认可监督委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：高宏伟、梁成珠、刘心同、王岩、于立欣、曹忠雷。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T 2271—2009青椒中转基因成分定性PCR检测方法1范围本标准规定了转基因青椒中外源基因 CaMV 35S、NPTⅡ、NOS、CMV 定性 PCR 检测方法。本标准适用于对青椒样品的转基因筛选检测，适用于抗黄瓜花叶病毒转基因青椒的鉴定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SN/T 1193基因检验实验室技术要求SN/T1204.植物及其加工品中转基因成分实时荧光PCR检测方法3术语、定义和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本标准。3.1术语和定义3.1.1转基因 transgene将本物种不具有的、来源于其他物种的功能DNA序列，通过各种导人手段，使其在该物种中进行表达，以便使该物种获得新的品种特征。3.1.2聚合酶链反应 polymerase chain reaction,PCR模板基因序列先经过高温变性成为单链，在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别于模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火雨相互结合，接着在DNA聚合酶的催化下以四种脱氧核糖核苷酸(dNTP)为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段呈几何倍数扩增。3.2缩略语3. 2. 1rbcL ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基基因，由植物叶绿体基因组编码。3.2.2CaMV 35S 35 promoter from cauliflomer mosaic virus花椰菜花叶病毒35S启动子。3.2.3NPT I neomycin phosphotransferase- I新霉素-3-磷酸转移酶。3.2.4NOS nopaline synthase terminator胭脂碱合成酶3转录终止子。1 SN/T 2271--20093.2.5CMV cucumber mosaic virus黄瓜花叶病毒。4原理样品经过提取DNA后，针对转基因植物所插人的外源基因的基因序列设计引物，通过PCR技术，特异性扩增外源基因的 DNA片段，根据 PCR 扩增结果，判断该样品中是否含有该转基因成分。检测先对提取的DNA进行内对照的扩增，扩出相应的内对照条带后可以进行筛选基因的检测，如果筛选基因为阳性,再进行鉴定基因的检测。如果筛选基因为阴性则直接报告结果。检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T 1193中的规定执行。5 试剂5. 1 PCR 用引物按照表1中提供的引物序列合成引物加入无离子水配成100,pmol/uL贮存，配成直接用于PCR反应的 10 pmol/μL的工作液，表1转基因青椒PCR*检测用的引物序列及PCR产物的大小类型引物序列片段/bp用途引物名称.F 5-aat ctt cta-etggtacaatggac-?rbcl.内源433内对照R 5-tca tca tct ttg gta aaa tca ag-3F 5-gct cct aca aat gcc atc a-3195外源筛选CaMV 35SR+-5*-gat-agtggg attgtg-cgt-ca-3.F 5-gaa tcc t