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黑曲霉木聚糖酶诱变及性质研究 低聚糖是一种又名的低聚糖。它是由2-7天的d-木糖-1和4-d组成的低聚糖。这是一种高度额外作用的食品添加剂，其主要有效成分为g8糖。在日本,低聚木糖被认为是最有前途的功能性低聚糖,已实现工业化生产并广泛应用。 国内外对木聚糖酶进行了较多的研究,已报道从黑曲霉、海枣曲霉、木霉、短小芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、链霉菌的培养液中纯化得到木聚糖酶。鉴于丝状真菌产酶的特点,如产生木聚糖酶胞外酶,便于酶的分离提取;产木聚糖酶的水平比一般细菌和酵母菌高;可以同时产生降解木聚糖支链所需的几种辅助酶等,便于工业化应用,因而对丝状真菌,尤其是曲霉属和木霉属的研究较多。低聚木糖生产用酶要求不含β-木糖苷酶或β-木糖苷酶活性低。由于木聚糖总是伴随着纤维素共存的,自然界中只产木聚糖酶或只产内切木聚糖酶的菌种较少,因此,基因突变是从自然界中获得低纤维素酶活的木聚糖酶或无(低)β-木糖苷酶活木聚糖酶优良菌株的重要方法。 作者在此采用紫外线照射诱变黑曲霉,筛选出低纤维素酶活的木聚糖酶高产菌株,分析了诱变后产木聚糖酶的活性,并对木聚糖酶定向酶解木聚糖进行了研究。 1 实验 1.1 仪器与设备 稻壳,市售;黑曲霉(A.niger),哈尔滨市微生物研究所。 所用试剂均为市售分析纯。 MJ-160B-Ⅱ型霉菌培养箱、SPX-150-Z型振荡培养箱,上海跃进医疗机械厂;洁净操作台,上海博迅实业有限公司医疗设备厂;电热手提式压力蒸汽消毒器,哈尔滨市松花江医疗器械厂;显微镜;离心机。 1.2 培养基 (1) 面培养基 PDA培养基。 (2) 平板训练 以木聚糖粗提物10%作为碳源,取代察氏培养基中蔗糖,再加0.2%的胆酸钠。 (3) 活塞注射培养基 改进Mandels培养基。 斜面得平板培养温度:32℃。 1.3 黑酶诱变 1.3.1 木聚糖菌株的筛选 出发菌株→增殖培养→新鲜斜面菌种→孢子悬液浓度调至5×106个·mL-1→紫外线照射→稀释涂粗木聚糖平板→挑选大的菌株→摇瓶初筛→复筛→高产菌株。 1.3.2 不同浓度wsf-1 将培养7 d的黑曲霉孢子斜面加入适量的无菌水,刮下孢子置于盛有玻璃珠的三角瓶中,在往复式摇床上振荡0.5 h (200 r·min-1),使孢子分散,稀释成1×106～1×107个·mL-1孢子悬液;将孢子悬液均匀铺于已灭菌的直径为 9 cm的培养皿中,成1 mm左右的薄层;于40 W紫外灯下,距离28 cm处照射2～5 min;稀释成一定的浓度梯度,涂布于PDA培养基上,28～30℃避光培养3～4 d,将诱变前后的稀释液平板计数,以致死率在85%的诱变条件为最佳。 1.4 黑酶诱导变量生产力的测定 采用DNS(3,5-二硝基水杨酸)法测定酶活。以自制木聚糖为底物,以1 mg·mL-1木糖为标准品。 (1) 供试酶液的制备 将诱变后的孢子在斜面培养基上增殖培养,用无菌蒸馏水制成孢子悬液,然后接种于产酶培养基中,于28℃培养120 h后,于4000 r·min-1离心10～20 min,即得供试酶液。 (2) 最大光吸收温度测定 移取1.8 mL木聚糖底物于25 mL具塞试管中,于40℃保温5 min;加入0.2 mL酶液,于40℃反应20 min;立即加入3 mL DNS试剂,混合均匀,于沸水浴中保温5 min,显色;用冷水迅速冷却后,加入20 mL蒸馏水,混匀,测定480 nm处的光吸收值。空白管则先加0.2 mL酶液,于沸水浴中保温5 min,使酶失活后,再加3 mL DNS试剂和1.8 mL木聚糖底物,混合均匀,于沸水浴中显色5 min,用冷水迅速冷却后,加入20 mL蒸馏水,混合均匀。 (3) 酶活性物质 在40℃和pH值4.8的条件下,每分钟产生1 μmol还原糖所需酶量定义为1个酶活力单位。 (4) 木聚糖稀释液的制备 将1 mg·mL-1标准木糖溶液用缓冲溶液稀释成0 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.3 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.7 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1标准木糖稀释液,设3个重复。其中以0 mg·mL-1木糖为空白对照,分别取0.2 mL标准木糖稀释液于25 mL具塞试管中,加入1.8 mL木聚糖底物,40℃保温20 min;加入3 mL DNS试剂,混合均匀,于沸水浴中保温5 min,显色;用冷水迅速冷却后,加入20 mL蒸馏水,混匀,测定480 nm处的光吸收值,绘制木糖标准曲线(图1)。 (5) 黑曲霉诱导的黑聚糖酶性质测定 分别在pH值3.0～7.0保温4 h、在30～80℃保温1 h,用DNS法测酶活。 1.5 还原糖浓度测定 (1)以木聚糖为原料,采用木聚糖酶定向酶解木聚糖