SN 1574-2005猪旋毛虫病酶联免疫吸附试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T旋毛虫病酶联免疫吸附试验操作规程Protocal of enzyme-linked immunosorbent assayfor trichinellosis of swine2005-05-20发布2005-12-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1574—2005言前本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山西出入境检验检疫局。本标准主要起草人：廉慧锋、李卫华、巩红霞、付英文、连庚寅。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1574—2005猪旋毛虫病酶联免疫吸附试验操作规程1范围本标准规定了猪血清中抗旋毛虫抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)检测的方法。本标准适用于猪血清中抗旋毛虫抗体的检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（epvISO3696:1987)3材料与试剂3. 1 猪旋毛虫病 ELISA 诊断试剂盒2℃～8℃保存。试剂盒内应包括的物品如下：包被好的96孔酶标板；抗旋毛虫阳性对照血清；抗旋毛虫阴性对照血清；-100倍浓度的酶标结合物；底物溶液；显色剂（ABTS）；一终止剂；一血清和酶标结合物稀释液；-10倍浓度的洗涤液。3.2待检血清按常规方法采血并分离血清，置4℃冰箱中备用，如需长期保存应置一20℃。4 仪器4.1酶标仪（波长405nm）。4.2恒温震荡器(37℃）。4.3高压灭菌器。4.48道或12道洗头洗板机。4.58道或12道移液器（50μL～300μL）。4.6↓单道移液器(0. 5 μL～10 μL;40 μL～200 μL;200 μL~1 000 μL)。5 试验准备5.1温度恢复将所有试剂(除酶标结合物外)在使用之前恢复至室温。5.2洗涤液取一份试剂盒内提供的浓缩洗涤液加人到九份蒸馏水中，混勾备用。稀释用蒸馏水应符合 SN/T 1574---2005GB/T 6682的要求。5.3酶标结合物将酶标结合物母液稀释，配成工作浓度（现用现配）。5.4底物将底物溶液与显色剂溶液按要求混合，然后轻轻震荡混勾(现用现配)。5.5终止液在终止剂小瓶内加人规定量的蒸馏水混匀制成终止液以备用。6操作程序6.1 血清稀释取5 μL待检猪血清加人到0.5mL血清和酶标结合物稀释液(以下简称稀释液)中,对待检血清进行稀释。阴性对照血清和阳性对照血清按要求进行稀释。6.2 对照在酶标板的 A1,B1 孔内加人稀释好的阴性对照血清,C1,D1 孔中加人稀释好的阳性对照血清,在E1孔中加人稀释液，每孔100μL。酶标板标号示意图见图1。21234678910111AA1B1OCc1OD1E1EIFGH图1酶标板标号示意图6.3加样在其余各孔中加人稀释的待检血清，每份待检血清加一孔，每孔100μL。6.4孵育将酶标板置 37℃恒温震荡器中孵育1 h,孵育后将各孔中的液体甩掉。6.5 洗涤每孔加人250μL～~300μL洗涤液，轻轻震动后甩掉，连续洗涤三次，最后一次洗涤后，将酶标板在吸水纸上轻拍，以去除孔内液体。6.6加酶标结合物在每孔中加人100 μL已稀释好的酶标结合物。6.7 孵育和洗涤重复6.4、6.5的操作。6.8加底物在每孔中奶人底物100uL，然后将酶标板在室温下暗处放置30min，轻轻摇晃酶标板，用405nm的波长测OD值。6.9 反应终止如果阳性对照血清孔的平均OD值≥1.000,阴性对照血清孔的平均OD值介于0.100～0.300之间（OD值计算见7.1），则向每孔加人50μL终止液。2 SN/T 1574—2005如果阳性对照血清和阴性对照血清的OD值不满足上述的要求，应继续将酶标板在室溢下暗处放置30min再加入终止液。6.10　测定OD值以稀释液孔OD值为空白对照，在405nm波长下读取每孔的OD值。结果计算和判定77. 1 结果计算分别按式(1)和式(2)计算阴性和阳性对照血清孔OD值的平均值,并按式(3)计算临界值。. OD A1 + OD B1NC 二(1)2式中:NC-一阴性对照血清孔OD值的平均值；ODA1-A1 孔阴性对照血清的 OD值;ODB1-B1 孔阴性对照血清的OD值。ODcl + OD p1PC =(2)2式中:PC阳性对照血清孔OD值的平均值；ODc1C1 孔阳性对照血清的OD值；ODp1-D1 孔阳性对照血清的 OD值。LV - 2.1 X NC.(3)式