甘蔗Ty3-gypsy类逆转座子RT基因的克隆及分析.docx

? ? 甘蔗Ty3-gypsy类逆转座子RT基因的克隆及分析 ? ? 刘俊仙，刘 菁，阳太亿，高轶静，段维兴，雷敬超，刘丽敏，刘红坚，张荣华，何为中，李 松，熊发前 * （1.广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所，广西 南宁530007；2.广西壮族自治区农业科学院经济作物研究所，广西 南宁530007） 0 引言 【研究意义】甘蔗广泛生长于热带和亚热带地区，不仅是世界上重要的糖料作物，也是我国重要的糖料作物、能源作物和经济作物，甘蔗产业对于保障国家蔗糖供给安全有着举足轻重的作用。LTR逆转座子具有普遍性、拷贝数丰富、高度异质性和插入位点多态性，非常适合用来开发分子标记。LTR逆转座子常被用来开发S-SAP（特异扩增多态性）[1]、IRAP（逆转座子位点间扩增多态性）[2]、REMAP（逆转座子-微卫星扩增多态性）[2]和RBIP（基于逆转座子插入多态性）分子标记技术[3]。而分离和鉴定LTR逆转座子是开发分子标记的前提。因此，克隆甘蔗Ty3-gypsy类逆转座子RT基因序列具有重要意义。【前人研究进展】吴子莺等[4]使用简并引物成功分离了甘蔗属大茎野生种60条Ty1-copia类逆转座子逆转录酶序列。Raza等[5]根据文献中报道的简并引物以及跟Mutator（Mu）和Activator（Ac）有同源性甘蔗的EST设计的引物，利用PCR技术从当地甘蔗栽培种BL4中扩增并分离出甘蔗的Ty1-copia类LTR逆转座子以及Mutator（Mu）和Activator（Ac）转座子，表明这3类转座子元件存在于甘蔗栽培种（BL4）基 因 组 中。Rossi等[6]利 用“transposable element”“transposase”“transposon”和“retrotransposon”为Key，以期望值低于e?50为搜索标准，搜索甘蔗EST数据库，结果鉴定出276条跟转座元件同源的序列，其中，DNA转座子148条（54%）、逆转座子128条（46%），逆转座子中的Ty1-copia明显多于Ty3-gypsy，没有发现SINE、LINE和M ITE序列。Rossi等[7]经过测序和比对从甘蔗EST数据库中鉴定出34条类mudrA序列，序列系统进化分析揭示出在单子叶和双子叶植物分化前植物界已经存在着4大类类mudrA序列，且至少有3类存在于甘蔗的祖先种中，且每一大类中具有转座活性的类mudrA序列成员的数目是变化的，所有结果表明甘蔗属中存在着活性的Mu转座子系统。De A raujo等[8]从甘蔗EST数据库中鉴定出276条跟植物转座元件同源的EST序列，经过cDNA全测序，68条甘蔗转座子序列被指定为11个家族，表达分析显示在同一个家族中的转座子不同成员呈现不同的表达模式，没有发现组织特异转座子家族，愈伤组织是转座子表达数量最大的组织，表明组织培养显著影响了不同转座元件的表达水平；De Jesus等[9]利用甘蔗EST数据库鉴定出转座子超家族hAT，并研究了它在甘蔗基因组中存在的多样性。Nakayama[10]从甘蔗野生种Saccharum robustum中分离出一个新的tourist类M ITE转座子，序列两端有TIR和TSD，该序列在甘蔗属基因组中呈现高拷贝数，在此基础上开发出的IMP分子标记技术可以厘清甘蔗属6个野生种的亲缘关系。Zhang等[11]综合运用多种生物信息学分析软件和分析策略鉴定了甘蔗属96个BAC克隆序列中的各类转座元件。Zhang等[12]发表了单倍体割手密AP85-441的基因组，长末端重复逆转座子在基因组中占45.62%，其中，Ty1-copia和Ty3-gypsy分别占14.19%和26.04%。【本研究切入点】目前，有关甘蔗LTR反转录转座子的研究鲜见报道。在国内，尚未见甘蔗Ty3-gypsy类逆转座子RT基因序列的克隆报道。【拟解决的关键问题】克隆糖蔗品种新台糖22的Ty3-gypsy类逆转座子RT基因序列，并进行序列特征分析，调查RT基因序列的组成和变异模式，分析与其他物种之间的系统进化关系，以期为下一步开发甘蔗LTR逆转座子的分子标记奠定基础。 1 材料与方法 1.1 材料 供试材料甘蔗品种为国内种植面积最大的糖蔗品种新台糖22。 1.2 甘蔗基因组DNA提取 甘蔗基因组DNA的高质量提取采用笔者先前建立的改良CTAB法[13]进行。 1.3 甘蔗RT基因扩增 甘蔗Ty3-gypsy类逆转座子RT基因的PCR扩增参照前人设计的简并引物进行，上下游引物分别为：Gyrt1：5′-AGMGRTATGTGYGTSGAYTAT-3′和Gyrt2：5′-CAMCCMRAAMWCACAM TT-3′，其中，R=A/G，Y=C/T，M=A/C，S=C/G，W=A/T，N=A/T/C/G[14]。