SN 1150-2002南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1150—2002植物检疫南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法Plant quarantine-Method for inspectionand identification of Arabis mosaic Nepovirus2002-11-25发布2003-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1150—2002前 言本标准根据南芥菜花叶病的形态学、生物学和血清学特性,结合植物病毒检疫的特点，确定了血清学DAS-ELISA和生物学鉴别寄主作为南芥菜花叶病毒检疫鉴定的主要依据。本标准制定过程中参考和比较了国内外近年来多项研究成果，在总结多年植物病毒检疫实践经验的基础上编制而成。本标准由认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：吴际云、陈枝楠、邓琼、吴琼。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。 SN/T 1150--2002植物检疫南芥菜花叶病毒检疫鉴定方法1范围本标准规定了进境植物检疫中对南芥菜花叶病毒的检疫鉴定方法。本标准适用于进境植物种子、苗木、繁殖材料和植物产品的南芥菜花叶病毒的检疫鉴定。2原理南芥菜花叶病毒（Arabis mosaic Nepouirus,英文缩写为 ArMV)为等轴多面体球状病毒，直径为30 nm，属线虫传多面体病毒属成员。主要分布于欧洲地区大部分国家、加拿大、大洋洲和南非等国家。该病毒具有广泛的寄主范围，约174属、215种，包括许多经济作物如瓜类、马铃薯、烟草、豆类、白菜、花椰菜、胡萝卜、甜菜、樱桃、桃、葡萄、草莓、郁金香、唐菖蒲等。根据危害症状随病毒株系、寄主种类不同而变化,病毒颗粒免疫原性强、容易制备高滴度的病毒抗血清等特点，血清学双抗体夹心法(DAS-ELISA)和鉴别寄主生物学鉴定方法可以作为检疫工作中检疫鉴定该病毒的依据。3仪器3.1研钵3.2微量榨汁机3.3酶标仪3.4低速离心机转速为4 000 r/min。3.5生物培养箱具有光照，温度可调范围为0℃～50℃。3.6酶联板48孔或96孔。3.7 Eppendorf 管体积为 1.5 mL。3.8微量移液器分为100μL、200μL、1000μL单头或100μL或200μL8孔道一支及相应吸头。3.9恒温水浴锅或恒温培养箱3.10　分析电子天平3. 11 pH计3.12白瓷盘(40cm×50 cm)及钝头镊子3. 13F隔离检疫温、网室4 试剂4.110XPBST缓冲液将氯化钠(NaCl)80g、磷酸二氢钾（KHzPO4)2g、磷酸氢二钠（NazHPO）11.5g、氟化钾（KCI)2 g、吐温 20(Tween-20)5 mL溶解于 1 000 mL蒸馏水中。1 SN/T 1150—20024.2样品提取缓冲液将亚硫酸钠(Naz SO:)1.3g、聚乙烯基吡咯烷酮(MW24～4000,PVP)20g、叠氮钠（NaN:)0.2g、吐温20(Tween-20)20mL溶解于1000mL PBST，用浓盐酸(HCI)调节pH值至7.4,并储存于4℃。4.3包被缓冲液将碳酸钠(NazCO;)1.59g、碳酸氢钠(NaHCO:)2.93g、叠氮钠(NaNs)0.2g溶解于1000mL蒸馏水中,用浓盐酸(HCI)调节 pH值至 9.6,并储存于 4℃。4.4洗涤缓冲液1XPBST 缓冲液,用浓盐酸(HCI)调节 pH 值至 7.4,并储存于 4℃。4.5酶标结合物缓冲液将1×PBST缓冲液800mI小牛血清白蛋白(BSA)2g、PVP(MW24～4000)20g、叠氮钠(NaN:)0.2 g,用蒸馏水定容至1000 mL,并储存于 4℃。4.6PNPP底物缓冲液将二乙醇胺97mL、叠氮钠(NaNs)0.2g溶解于1000mL蒸馏水中，用浓盐酸(HCl)调节pH值至9.8,并储存于4℃。4.7 PNPP 底物溶液将 4-硝基酚磷酸钠盐（p-nitropHenylpHospHate英文简写为 PNPP)100 mg溶解于PNPP缓冲液100mL，现用现配制。4.8终止反应液氢氧化钠(NaOH)40g溶解于1000mL蒸馏水中。4.9种子表面消毒液将30%次氯酸钠100mL溶解于900mL蒸馏水中制成浓度为3%的消毒液。4.10生物试剂可采用南芥菜花叶病毒检测试剂盒或生物检测试剂。包括南芥菜花叶病毒抗体（IgG)，碱性磷酸酶标记的南芥菜花叶病毒酶标抗体（IgG-Enzyme-Conjugated），阳性对照和阴性对照。4.112%醋酸铀染液将 2g醋酸铀溶解于98mL蒸馏水中，定溶至100 mL,现配现用。注：未作特殊说明，所使用试剂均为分析纯。5 现场检疫与抽样5.1抽查按货物批量总件数的5%～20%随机抽查，最低抽查件