SN_T 4043-2014蚊类携带丝虫（班氏丝虫、马来丝虫）的PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4043—2014蚊类携带丝虫（班氏丝虫、马来丝虫)的PCR检测方法PCR methods for detecting Wuchereria bancrofti andBrugia malayi in mosquitoes2015-05-01实施2014-11-19 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局电话4009821刮涂层查真伪 SN/T 4043--2014前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国甘肃出人境检验检疫局、中华人民共和国四川出人境检验检疫局本标准主要起草人：田虹、刘丽娟、刘芳、高玉峰、陈肖潇、张红兵。I SN/T 4043—2014蚊类携带丝虫（班氏丝虫、马来丝虫)的PCR检测方法1 范围本标准规定了国境口岸蚊类携带班氏丝虫和马来丝虫的PCR检测方法，包括样本检测程序、检测方法、结果判定及报告。本标准适用于检验检疫机构对蚊类携带班氏丝虫和马来丝虫的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室　生物安全通用要求WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则SN/T1300国境口岸蚊类监测规程SN/T1553人出境航空器医学媒介生物监测规程SN/T1560人出境船舶医学媒介生物监测规程SN/T 15966人出境车辆医学媒介生物监测规程医学媒介生物标本采集、制作及保存规程SN/T 1876 I3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1丝虫 Filaria是由吸血节肢动物传播的一类寄生性线虫。成虫寄生在脊椎动物终宿主的淋巴系统、皮下组织、腹腔、胸腔等处。幼虫在某些吸血节肢动物中间宿主体内进行发育。当这些中间宿主吸血时，成熟的感染期幼虫即自其喙逸出，经皮肤侵人终宿主体内发育为成虫。寄生于人体的丝虫主要有8种，我国流行的主要以班氏丝虫（Wuchereria bancrofti）和马来丝虫（Brugia malayi）为主。二者形态相似，虫体皆为乳白色丝状，体表光滑，雌、雄异体。3.2蚊类Mosquito班氏丝虫的主要传播媒介为淡色库蚊（Culea pipiens pallens）和致倦库蚊（Cr.pipiensquinque-fasciatus），马来丝虫病的主要媒介为中华按蚊（Anopheles sinensis）和嗜人按蚊（An.anthropophagus）等。3.3PCR 技术 polymerase chain reactionPCR技术是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等11+ SN/T 4043--2014特点。本文件中采用 PCR技术，参考 Kirti Mishra 等的文献(Combined detection of Brugia malayi andWuchereria bancrofti using single PCR），分别合成马来丝虫和班氏丝虫的特异引物 Hha l和 Ssp I,扩增目标DNA片段为322bp和188bp的方法。4缩略语下列缩略语适合于本文件。dNTP:脱氧核苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate)PCR:聚合酶链反应（polymerase chain reaction)SDS:十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate)Taq 酶:Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerse ）5检测对象出人境交通工具、集装箱、货物以及口岸等场所捕获的媒介蚊虫，主要以淡色库蚊（Culex pipienspallens）、致倦库蚊(C.pipiens quinquefasciatus）、中华按蚊（Anopheles sinensis）及嗜人按蚊（An.anthropophagus)为主。6生物安全要求实验过程中生物安全要求如下：检测工作中的个人防护参照GB19489;实验室应遵循GB19489和WS233对生物安全2级（BSL-2)实验室的生物安全要求；使用过的实验用品应遵循GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。7主要试剂主要试剂如下：一样本处理液:在新鲜配制的 97 mLMEM中加人56 ℃热灭活 30 min 的胎牛血清2 mL、1 mL的青链霉素（青霉素G10000U/mL、链霉素10000μg/mL），用7.5%碳酸氢钠溶液调至p