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姜黄素衍生物的合成及生物活性研究 酪氨酸酶（ec1.14.18.1）是一种广泛存在于动植物和微生物中的金属酶。它具有单酚酶和二酚酶的特性。这是生物合成黑色素的重要酶。通过抑制其活性，可以抑制黑色素的形成。因此，氨基酸酶抑制剂广泛应用于复合物和医药行业作为皮肤增白剂，以及食品作为预防腐败和保新鲜素。在化妆品行业中,目前已有一些酪氨酸酶抑制剂作为化妆品美白添加剂投放于市场,如曲酸及其衍生物、维生素C及其衍生物、熊果苷、多酚黄酮类等,它们可以淡化皮肤黑色素,具有增白效果,这些抑制剂均是来源于天然产物或其衍生物。近年来,对天然植物有效成分及其衍生物对酪氨酸酶抑制作用的研究一直受到重视。 姜黄是一种传统中药,中医认为姜黄能行气、散风活血、通经止痛。姜黄素是姜黄最主要的活性成分,同时还含有单去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素。姜黄素具有抗炎、抗氧化、防癌、抗癌、抗动脉粥样硬化及降血脂等功效,在食品和化妆品中可用作天然色素和抗氧化剂。近年来,姜黄素作为功能性成分添加到化妆品中的应用越来越受到重视,作者曾对姜黄素的生物活性及其在化妆品中的应用进行了综述。杨柳依等对14种中药成分对酪氨酸酶抑制作用的研究也表明姜黄素对酪氨酸酶具有显著的抑制作用。由于姜黄素在光照及中性或碱性条件下极不稳定,直接用于化妆品配方中,可能存在皮肤着色及有效成分变化等问题,对其进行氢化及酚羟基上的乙酰化和醚化等结构修饰,可提高其稳定性并减轻皮肤着色问题。为了较系统研究姜黄素类化合物对酪氨酸酶的抑制效果,作者从姜黄的超临界提取物中分离出姜黄素(C1)、单去甲氧基姜黄素(C2)及双去甲氧基姜黄素(C3)(图1),并对姜黄素(C1)进行了引入羧酸基团、乙酰化、氢化等的结构修饰(图2),同时研究了它们对酪氨酸酶的抑制作用。 1 实验部分 1.1 仪器、检测方法 姜黄素提取物,自制;酪氨酸酶(比活力为6 680 U/mg),Sigma公司;熊果苷,上海辛谱公司;所用试剂均为分析纯。双目镜X-6型显微熔点测定仪,北京泰克仪器公司;Varian Unity INOVA 300型核磁共振仪(1HNMR谱300 MHz,TMS为内标),日本岛津制作所;LCMS-2010A型质谱仪,日本岛津制作所;UV-2501PC型紫外分光光度仪,日本岛津制作所;XT200A型电子分析天平,瑞士Pracisa公司;H-1微型旋涡混合器,上海精科实业有限公司;硅胶薄层色谱板(TLC),广州东征试剂有限公司。 1.2 姜黄素c 参照文献方法从姜黄CO2超临界萃取物中分离提纯姜黄素(C1)、单去甲氧基姜黄素(C2)及双去甲氧基姜黄素(C3)。通过核磁共振波谱(NMR)、质谱(MS)及元素分析确定结构,与文献报道一致。 1.3 姜黄素的结构 1.3.1 化合物s1-1的合成 将200 mg姜黄素(1.62 mmol)溶于40 mL丙酮中,加入4 mL氯乙酸乙酯、40 mg NaI和314 mg无水碳酸钾,加热回流24 h。过滤,浓缩溶液,用硅胶柱层析纯化,洗脱液为环己烷/乙酸乙酯/乙醇(V(C6H12)∶V(CH3COOC2H5)∶V(C2H5OH)=4∶5∶1),得到229 mg化合物C1-1,产率为78%。将200 mg C1-1溶于20 mL丙酮/水(V(CH3COCH3)∶V(H2O)=4∶1)中,加入22 mg KOH,不断搅拌,直至TLC检测到C1-1反应完全。用稀盐酸酸化反应液,蒸馏除去丙酮,并用乙酸乙酯萃取。收集乙酸乙酯层,用无水硫酸钠干燥,蒸馏除去溶剂,用V(C2H5OH)∶V(H2O)=2∶1重结晶,得177 mg C1-2,产率为99%。两步总产率约为77%。 C1-2:黄色针状晶体,m.p.194 ℃～195 ℃;ESI-MS m/z:483[M]-;1HNMR(DMSO-d6,300 MHz,TMS)δ:7.53(d,J=15.9 Hz,2H),7.33(s,2H),7.19(d,2H),6.85(d,J=15.9 Hz,2H),6.81(d,J=8.1 Hz,2H),6.09(s,1H),4.72(s,4H),3.81(s,6H)。 1.3.2 fab-msz的制备 将368 mg姜黄素(1.0 mmol)溶于20 mL乙酸乙酯,加入255 mg乙酸酐(3 mmol)及1滴H2SO4,加热到60 ℃并搅拌,1 h后,加入10 mL水。静置分层,水层用10 mL乙酸乙酯萃取,合并乙酸乙酯层,用Na2SO4干燥,蒸馏除去溶剂。用甲醇和乙腈重结晶,得C1-3386 mg,产率为99%。 C1-3:黄色针状晶体,m.p.82 ℃～84 ℃;FAB-MS m/z:453[M+1]+;1HNMR(DMSO)δ:7.58(2H,d,2,6-CH=),7.14～7.49(6H,m,Ar-H),6.97