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应用issr标记分析安徽大别山区球孢白僵菌遗传多样性 白僵尸病毒（bal.）是自然森林生态系统中最常见的昆虫致病性真菌。它是世界上最常见的昆虫。主要昆虫有750多种。这是昆虫自然调节的重要因素，也是控制昆虫疾病的重要手段。广泛应用于我国的各种蝗虫、农业害虫和土壤侵蚀的防治。其中，每年使用200多万公顷松茸，以获得重大的经济、生态和社会成果。 然而,在白僵菌自然群体中存在较大的异质性和较高的遗传多样性,不同菌株对寄主昆虫的毒力存在较大差异。因此,加强对种内不同菌株间遗传多样性和亲缘关系的研究有助于更好地了解和阐明群体遗传结构、基因流、菌株分型以及人为引种后的宿存动态和环境安全性。 近年来,随着分子生物学技术的迅猛发展,人们开始从分子水平上对球孢白僵菌的多样性进行研究,从而弥补了传统形态分类和培养性状高度变异的不足,给种下菌株的亲缘关系鉴定提供了可靠的依据,有助于加强对球孢白僵菌遗传多样性的研究以及林间释放菌株的检测和鉴定。迄今,已有多种DNA分子标记,如限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、扩增酶切片段长度多态性(AFLP)、序列特异扩增区域(SCAR)、微卫星标记(Simple Sequence Repeats, 简称为SSR)等已应用于虫生真菌的遗传多样性、群体结构等研究。但不同的分子标记有各自的优缺点,在实际应用时受到一定的限制。因此,为了更好地进行种下菌株亲缘关系的鉴定、群体遗传学和林间释放菌株的检测等研究,还需开发更多的多态性高、稳定性好、易操作的其他DNA分子标记。 锚定简单序列重复(inter-simple sequence repeat,简称ISSR)是由Zietkiewicz等于1994年创建的一种简单序列重复区间扩增多态性的新型的分子标记。ISSR标记根据真核基因组广泛存在SSR的特点,利用在基因组中常出现的SSR本身设计引物,PCR扩增的引物通常为16～18个碱基序列,由1～4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,无需预先克隆和测序。ISSR分子标记与RAPD和AFLP等分子标记相比,由于其引物序列较长,退火温度高,具有更高的重复性,且操作简单,是一种非常理想的检测种内遗传变异的分子标记。 本文选用不同的ISSR分子标记对安徽大别山区不同时期和不同海拔高度采集的48株球孢白僵菌进行了遗传多样性分析,旨在开发这一新的分子标记应用于虫生真菌遗传多样性、群体遗传学和生态学等研究。 1 材料和方法 1.1 菌株采集地点、时间、原始监测技术和生境 供试48个菌株分别采自安徽大别山地区两个国家级自然保护区(岳西县鹞落坪自然保护区和金寨县天马自然保护区),各菌株具体的采集地点、采集时间、原始寄主和海拔等信息见表1。采集的僵虫经SDAY培养基分离、纯化、鉴定后,保存于安徽农业大学省微生物防治重点实验室。 1.2 养基、菌株的制备 将上述供试菌株制成孢子悬浮液,取0.3 mL转接于加铺玻璃纸的SDAY培养基(含4%葡萄糖,1%蛋白胨,1%酵母浸膏,1.5%琼脂)平板上,倒置于恒温光照培养箱中25±1℃培养4～6 d,将长满全皿而未大量产孢的菌体在无菌条件下取出,置于5 mL的灭菌离心管中,经冷冻干燥后于-20℃保存备用。 1.3 pcr扩增效果及可重复性检测 参照朱衡的方法提取菌体总DNA。以1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA。用Eppendorf分光光度计测得浓度后,将样品浓度稀释到10 ng/μL备用。 为了得到有效的ISSR分子标记,对合成的19个ISSR引物(上海英俊生物技术有限公司)进行了前期预筛选试验。以Bb272-Bb282共10个菌株的DNA为模板,在15 μL反应体系中进行引物扩增效果及可重复性检测。最终从19个引物中选出12个扩增条带清晰、重复性好及多态性高的ISSR引物用于48个菌株的PCR扩增(表2)。 1.4 pcr扩增程序 ISSR-PCR扩增反应在Flexigene PCR仪(TECHNE公司)上进行。反应体系(15 μL)如下:1.5 μL 10×PCR buffer (200 mmol/L Tris-HCl, pH 8.4, 2.5 mmol/L MgCl2, 500 mmol/L KCl), 0.25μL mmol/L dNTPs(北京鼎国生物技术有限公司), 0.6 μmol/L 引物(上海英骏生物技术有限公司), 0.5 UTaqDNA polymerase (北京鼎国生物技术有限公司)和20 ng模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性2 min, 接着进行35个循环:94℃变性45 s,48～54℃复性45 s,72℃延伸1.5 min。循环结束后72℃延伸10 min。PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶上电泳分离,EB染色后于Tanon GI