微小态势性微球藻溶血活性的提取及初步分析.docxVIP

微小态势性微球藻溶血活性的提取及初步分析 1 溶血毒素及溶血活性 小罗内河是海水和自然水体中常见的裸甲藻种类。在传统的显微镜试验中，它被视为另一种常见的有毒海生海藻，因此在监测和研究赤潮时往往被忽视。该藻于20世纪50年代在南非首次被发现后,在南卡罗莱纳州的海水澄清池、美国切萨皮克海湾和马里兰州海湾等多处发生过大规模赤潮,造成鱼类大量死亡,文献同时指出鱼类致死的主要原因是该藻分泌的溶血毒素使鱼的鳃部发生溶血现象,导致呼吸受阻窒息而死。国内,微小卡罗藻曾于2003年4月在香港水域形成高密度赤潮,但并未见到相关鱼类死亡的报道。2005年,在浙江海区米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)赤潮水样中也检测到该藻。目前,我国对于微小卡罗藻溶血毒素的生物化学认识,包括溶血毒素的化学性质、主要种类以及溶血强度等都尚未见报道。 在溶血毒素生成特征方面。许多赤潮藻都有其特定的产毒时期段,如Akiko等发现Alexandrium taylory对数生长期时开始分泌溶血毒素,随后分泌量逐渐增加,即使在衰亡期仍能分泌溶血毒素。球形棕囊藻在对数生长期并未表现出溶血活性,但进入平稳期和衰亡期呈现出一定的溶血活性,并于衰亡期达到最强。本文研究的微小卡罗藻具有溶血毒已经确证,但其在不同生长阶段的产毒情况还是未知,并且有报道指出该藻藻液溶血活性时有时无,这就有必要对该藻整个生长周期进行溶血活性检测。在溶血物质研究方面,Place等从美国切萨皮克海湾中的微小卡罗藻中分离获得了几种有毒化合物类群,被称作Karlotoxins,这是一类具有鱼毒性、溶血毒性和细胞毒性的化合物,部分提取方法和毒素应用正在美国形成专利。但是,在其专利中并没有得出明确的化合物结构,因此对其毒素的结构研究尚待深入。 本文对微小卡罗藻溶血活性的生长期特征及其溶血毒素的种类进行研究,为进一步研究该藻溶血毒素的生成机制及化学结构解析提供参考。 2 材料和方法 2.1 培养nmhah497的f/2条件 微小卡罗藻为宁波大学海洋生物工程重点实验室微藻种质库提供的NMBjah047品系。采用f/2培养液配方进行培养,培养温度22 ℃,光照40 μmol/(m2·s),光暗循环为L∶D=12h∶12h。溶血试验所用血细胞取自市购鲫鱼。 2.2 藻细胞溶血活性测定 取对数生长期的微小卡罗藻重新接种于新鲜培养液中,培养条件如上所述,接种密度约为3.5×104个/ml,每天定时用血球计数板计数,绘制藻细胞的生长曲线,并依据生长曲线分别取延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期的藻液进行取样,经5 000 r/min(4 ℃)离心得藻细胞与去藻上清液,做溶血活性测定(步骤2.3)。 2.3 鱼类融资剂pbs的体外培养和酶活性检测 往以上各组藻细胞中加入100 μl的PBS缓冲液,超声破碎25 min,镜检无完整细胞后,经13 000 r/min(4 ℃)离心得藻细胞PBS萃取液。 各取100 μL的藻细胞PBS萃取液和去藻上清液,置于无菌的200 μlPCR管中,加入等体积的4%鲫鱼血细胞悬浮液,于40 μmol/(m2·s)光照,29 ℃下培育5 h。实验中以4%鲫鱼血细胞悬浮液作为零溶血对照组,加1% Triton X-100的鲫鱼血细胞悬浮液作为100%溶血对照组。培育后PCR管内各组于1 000 r/min(4 ℃)离心10 min,各取100 μl上清液于平底的96孔板上,在酶标仪550 nm处测吸光度。溶血度计算方法参考文献。 2.4 溶血毒素的提取和分离 2.4.1 去藻上清液的溶血活性 经实验2.2可知,稳定期微小卡罗藻的藻细胞和去藻上清液都有较高的溶血活性。故用乙酸乙酯将稳定期的藻液以1∶2的体积比萃取3次,合并3次萃取液用旋转蒸发器减压浓缩,低温保存备用。 (1) 氯甲烷和乙氧溶液 采用硅胶柱层析(硅胶100-200目)对乙酸乙酯浓缩液进行分离。用分步洗脱法,洗脱剂配比为二氯甲烷;二氯甲烷和乙醚溶液(V∶V=35∶1);二氯甲烷和乙醚溶液(V∶V=9∶1);二氯甲烷和甲醇溶液(V∶V=9∶1);二氯甲烷和甲醇溶液(V∶V=1∶5);甲醇,各以6倍柱体积洗脱。各洗脱组份经减压浓缩后,取适量经过N2吹干,用PBS缓冲液定容到100 μl,进行溶血试验(注:以下各溶血试验法与此相同)。 (2) 紫外吸收法rck 溶血活性较强的几组组份作为进一步细分的起始样品。使用薄层硅胶板(TLC Silica gel 60 F254,Merck),用毛细点样管条状点样,以各洗脱剂为展开剂,展层后置于WFH-203三用紫外分析仪中观察紫外吸收条带,并喷淋5%磷钼酸-乙醇溶液(磷钼酸/乙醇:m/v=5/100),自然晾干后,用电吹风加热至显色。计算每条谱带的Rf值,刮取每条谱带,合并相同Rf值的谱带,用各自洗脱