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elisa一步法检测乙型肝炎表面抗原的操作要点 表面抗原试验是诊断出独具特色的肝细胞疾病的主要指标。随着检测技术的不断发展, ELISA一步法检测HBsAg的试剂、方法均已成熟, 因其方法简便、灵敏度高、特异性强、实验要求条件不高而被各级医疗机构广泛采用。但其方法的缺点是干扰因素特别多, 在实际操作中每一步控制不好都可能影响检测结果的质量, 现针对操作中可能出现的问题进行分析, 旨在提高HBsAg检测结果的准确性。 1 出现假阴性时 从冰箱 (4±2) ℃中取出试剂盒, 放置于37 ℃环境恒温15 min, 如放置室温, 达不到抗原抗体反应温度, 可能会出现假阴性。操作中一定要使用一次性吸头, 避免交叉感染。加样品要用50 μl加样器, 加样要准确。配置洗液时, 蒸馏水质量要达标, 配置量要准确。 2 血液样品的质量 2.1 进行离心分离血清 由于血液中某些成分影响, 尽量采用血清为标本, 血标本放4 ℃冰箱中过夜后检测, 标本检测前用较大离心转速进行离心分离血清。原因: (1) 血清中混有一定浓度的红细胞时, 由于红细胞表面有大量的活性物质, 容易与反应孔发生非特异性吸附, 黏附于孔壁不易被洗脱, 加入底物显色后出现假阳性。 (2) 抽血后如检测过早, 由于血清中纤维蛋白没有完全沉淀, 血清中过多的纤维蛋白有类同于红细胞与反应孔相吸附的作用而出现假阳性结果。 2.2 血红蛋白检测 (1) 脂血或乳糜血可能造成血清黏度加大或屏蔽抗原抗体之间的相互作用, 从而降低抗原抗体的结合, 使结果出现假阴性。 (2) 溶血是由于各种原因引起红细胞破坏, 细胞内血红蛋白进入血液, 血红蛋白具有类似于过氧化物酶的活性, 其作用与辣根过氧化物酶相似, 如果反应孔非特异性吸附血红蛋白残留, 可催化底物显色, 造成假阳性。因此注意采集、保存标本, 避免溶血。 (3) 血清中的补体, 类风湿因子、免疫球蛋白聚合物也可以影响造成假阳性结果, 不同时期多次采血有助于减少假阳性。 3 加酶、除酶 严格按照操作说明书操作。酶加量过多, 显色剂在空气中暴露时间太长, 恒温箱温度失控, 酶失活, 加酶或显色剂后反应时间过长, 会引起假阳性结果;恒温箱不够37 ℃, 温浴时间不够, 试剂开启时间长长菌, 加样器吸量不够, 没达到抗原抗体反应最佳状态, 显色反应时间不足, 这些会引起假阴性结果。 4 洗板及浸泡时间 最恰当的洗板次数为5～6次, 洗液要加到“要流还没流, 没流就要流”的状态, 这样能洗去残留在孔内的酶标记物、血清中的过氧化酶等, 取得好的洗涤效果。洗板次数过多, 浸泡时间过长, 用力冲洗过猛等容易把结合在孔底的抗原抗体复合物洗走而出现假阴性;洗板次数太少, 残留在微孔板上的酶标抗体的酶会使后加的无色底物转变成有色产物, 产生非特异性反应而出现假阳性。洗板时用的吸水纸要一次性使用, 清洗液要经常更换。 5 elisa二步法检测hbsag表达 37 ℃暗置15 min, 过长过短都可能引起假阳性和假阴性。制定灰色区, 对在灰色区周围的结果必须进行复查, 从而避免操作误差。 临床上一些危重患者大剂量使用维生素C, 高剂量的维生素C和ELISA一步法中的酶结合物辣根过氧化物酶发生氧化还原反应, 结果出现假阴性。检验人员应该了解患者用药情况, 若患者使用了高剂量的维生素C, 建议用ELISA二步法检测HBsAg。血清中HBsAg浓度过高时会引起钩状效应。一般认为, 产生钩状效应的原因是, 当抗原和抗体比例适当时, 形成较完整的免疫复合物网络结构, 使蛋白质分子的疏水结构充分暴露而易产生沉淀反应。反之具有一定的溶解度或发生可逆溶解作用。当待测抗原浓度过高时, 过量的抗原分别和固相抗体结合, 抗原抗体反应比例不当而不形成夹心复合物, 所得结果低于实际含量而出现假阴性, 因此临床上只作单项HBsAg检测, 可能造成漏检, 应结合两对半, 临床表现和实验室检查进行结合诊断。