elisa检测hcv的影响因素及临床应用.docxVIP

elisa检测hcv的影响因素及临床应用 elisa方法的原理是抗剂或抗剂的固相化，以及抗剂或抗剂的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性, 酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性, 又保留酶的活性。在测定时, 受检标本 (测定其中的抗体或抗原) 与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体, 也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后, 底物被酶催化成为有色产物, 产物的量与标本中受检物质的量直接相关, 故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高, 间接地放大了免疫反应的结果, 使测定方法达到很高的敏感度ELISA检测抗HCV目前是医院的常规检测项目, 虽然该方法操作简单, 灵敏度高, 但在实际操作中, ELISA检测抗HCV结果假阴性、假阳性问题还是比较常见, 该临床诊断给治疗带来很大困难。影响ELISA检测抗HCV因素众多。现就比较常见的影响因素加以分析总结。 1 hcv感染诊断 目前ELISA检测抗HCV试剂盒均采用HCV基因工程或合成多肽抗原核心区, NS3, NS4, NS5等包被固相, 由于不同厂家HCV抗原组合不同, 来源和用量方面也有差异, 就造成临床上使用不同厂家的ELISA检测抗HCV试剂盒检测结果有很大差异, 经常是这家试剂检测阳性, 另一家试剂检测阴性, 尤其是较弱阳性标本, 这不但是这部分患者HCV感染的临床诊断不明确, 而且在筛检献血员时, 极易发生漏检, 造成输血后HCV感染。 2 内源性材料的影响 由于患者体内特有内源性物质的存在, 与固相HCV抗原非特异性结合而造成假阳性结果。 2.1 elisa检测抗hcv过程中的rf 类风湿因子可大量存在于类风湿性关节炎及某些自身免疫性疾病患者血液中, RF有与变性的IgG非特异性结合的性质, 在ELISA检测抗HCV过程中, 标本中的RF就与固相上的IgG及酶标记IgG结合, 出现假阳性反应。 2.2 高免疫球蛋白血浆干扰 血清中高浓度的非特异性免疫球蛋白可与酶标记IgG结合, 非特异性的吸附在固相表面, 造成假阳性。 2.3 超氧化物诱导酶sod的干扰 用于包被固相的重组HCV抗原片段C-100如为酵母菌产生的SOD融合蛋白, 那么标本中SOD会造成HCV片段的假阳性。 3 elisa测定条件的优化 加样 血清或血浆标本分离不好即进行加样;手工操作中, 加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长 (特别是室内温度较高时) ;加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。 标本为血清 最好将血液先自然存放1～2 h后, 再用3000 rmp离心15 min;标本为血浆:必须使用含抗凝剂的血液标本收集管, 采血后必须立即颠倒采血管混合5～10次, 放置一段时间后, 3000 rmp离心15 min;若在几天内检测, 可放在2～8℃冰箱中, 若要贮存, 则置于-20℃的低温冰箱内。 加样后及时放入孵箱。 加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。 如果采用AT或其他全自动加样, 最好选择FAME或其他后处理仪器加酶试剂。 孵育 孵育时未贴封片或加盖, 使标本或稀释液蒸发, 吸附于孔壁, 难于清洗彻底;孵育时间人为延长, 导致非特异性结合紧附于反应孔周围, 难以清洗彻底。贴封片或加盖, 按说明步骤严格控制操作时间。 洗板 采用手工洗板, 孔与孔之间液体交叉。采用半自动洗板机洗板时, 洗液量不足, 导致洗板不彻底;洗板针堵塞, 抽吸不完全;洗板不畅, 导致洗板效果差。反应板过多造成洗板等待时间长。保证洗液注满各孔, 洗板针畅通, 洗完板后最好在吸水纸 (选择干净、无或少尘的吸水材料) 上轻轻拍干。 显色 显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂;加显色剂时溅出孔外造成液体回流。显色剂尽量在临用前配制, 坚持不用过期显色剂, 肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用;加样时保持显色剂不外流;A、B液应避免接触金属器械。 终止 加终止液时产生较多气泡, 导致假阳性增加, 加终止液时应避免产生气泡。 读板 读板时板底不清洁。应保证酶标板清洁。 温育的影响 温育是ELISA测定抗HCV影响结果的关键因素, 温育时间不够, 弱阳性标本检测不出, 温育温度不够, 弱阳性标本也难以检出。 洗板的影响 洗板对ELISA测定HCV来说也是关键步骤, 洗板分手工洗板和机器洗板, 一般认为机器洗板较手工洗板效果要好, 关键是洗板次数的选择。洗板次数较少, 造成残留, 可引起假阳性结果。洗板次数过多, 可造成抗原抗体结合物洗脱, 造成假阴性结果 显色的影响 显色影响的关键是显色温度和显色时间, 有些实验室操作人员不严格按说明书操作, 因为